CRISPR-Cas9系统是目前最流行的基因组编辑技术，可以实现目的基因的敲除、插入和突变，该技术是一种由RNA指导Cas蛋白对靶基因定性修饰技术。科学家为了让Cas蛋白定向剪切DNA序列，在CRISPR工作机理的基础上，人为重组了一段目的基因的sgRNA（small-guide RNA），在sgRNA的引导下，Cas9蛋白可以实现对目的基因的定向切割。本文主要介绍，目的基因sgRNA设计和如何将sgRNA构建到CRISPR-Cas相关载体。

 

“

1. 目的基因sgRNA设计

”

目前设计sgRNA的网站比较多，张锋老师实验组总结了sgRNA设计工具如：https://zlab.bio/guide-design-resources，其中synthego（https://www.synthego.com/products/bioinformatics/crispr-design-tool）是小编比较喜欢用的设计工具。不过该网站只能设计人、果蝇和小鼠基因的sgRNA。以人的基因TP53为例，介绍TP53基因sgRNA的设计过程。

1.1 打开synthego网站sgRNA设计工具，点击Launch Design Tool

1.2 选择种属人Homo sapiens，人的TP53基因的ID号为7157，选择TP53基因，点击search；

1.3 搜索结果分两部分：推荐的sgRNA和所有的sgRNA。往下滚动滚轮，会看到四条推荐的sgRNA的序列。

1.4 点击其中一条sgRNA序列，会看到sgRNA在TP53基因上的具体作用位置；

 

“

2. sgRNA重组构建

”

以lentiCRISPRv2载体为例，说明sgRNA是如果构建到该载体中。首先，将设计好的sgRNA中的U碱基改成T碱基，如TP53基因的sgRNA序列为5’-CAUUGCUUGGGACGGCAAGG-3’，修改后的碱基为5’-CATTGCTTGGGACGGCAAGG-3’，该序列的反向互补序列为3’-GTAACGAACCCTGCCGTTCC-5’。正向序列和反向互补序列退火成双链后就可以连接到载体中，但是需要在序列两端添加BsmBI酶切后的同源序列，如下图所示：

在生工生物合成这两条互补的序列后，退火成双链就可以连接到用BsmBI酶切后的LentiCRISPRv2载体中。sgRNA载体构建具体的操作过程如下。

2.1 LentiCRISPR载体酶切和去磷酸化，用BsmBI在37℃酶切30min；

2.2 琼脂糖凝胶纯化酶切的LentiCRISPRv2载体

LentiCRISPR载体的大小为14,873bp，酶切后产生两个片段，一条大的为目的片段，小片段大小为1885bp。在LentiCRISPRv2载体中有两个BsmBI酶切位点，两个位点之间的片段为1885bp，酶切连接后sgRNA正好在U6启动子下游，连接后的sgRNA下游就是gRNA scaffold序列，与sgRNA一起转录出来发挥gRNA的引导功能。

2.3 磷酸化和Oligo退火成双链DNA；

反应条件如下：37℃  30min → 95℃  5min，然后按照5℃/min降温到25℃。

生工生物可以提供磷酸化修饰的引物，可以选择在Oligo的5’磷酸化修饰，就不需要用T4 PNK磷酸化Oligo链了。

2.4 稀释退火的Oligo链；

上一步退火后的双链DNA，按照1:200用水稀释。

2.5 双链Oligo与酶切的载体连接（室温连接10min）

2.6 转化到Stbl3细菌；进行后续筛选。