NCBI在线引物设计

1、寻找基因序列

PubMed: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed

以human p53为例进行引物设计。

①选择核苷酸

②输入基因+物种+mRNA

③搜索

④单击选择 mRNA。

⑤单击进入，此条目为我们所寻找的p53 human mRNA。

⑥单击选择FASTA序列格式。

⑦单击选择“pick primers”即可跳转到Primer-BLAST页面。

2、参数设置

①选择PCR模板区。

②输入FASTA格式的序列或Accession Number，或者点击“选择文件”载入。

③可设置正向引物和反向引物的起始和终止位置。

④选择引物参数区。

⑤若你自己设计好了引物，可在此输入引物验证引物好坏。

⑥可输入PCR产物的大小和Tm值参数。

⑦内含子/外显子选择区

框内可选择引物设计是否跨越内含子。

⑧引物特异性验证区

六种数据库可供选择，推荐使用“Refseq representative genomes”数据库，用户也可使用自己的序列作为搜索数据库。

3、引物序列输出

引物的可视化结果，可以显示所有引物的起始和终止位置，基因的CDS区，外显子的位置等。

Self complementarity值越小越好。

根据引物设计原则选择最佳引物序列，示例中的最佳引物序列为Primer pair 3，把引物复制下来发给引物合成公司合成即可。

Primer Bank

1、ID查询

以human p53为例进行引物设计，p53在human中的基因名为TP53，进入网站后，点击选择基因，输入基因+物种，最后点击搜索

PubMed：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed

如何寻找的TP53基因，以下图为例：

用PrimerBank设计引物不仅可以用基因信息搜索，同样可以通过mRNA和蛋白搜索，只需利用NCBI找到对应的ID输入即可。

2、基因信息输入

进入PrimerBank网站后，选择数据库类型、物种，输入Gene ID，最后点击提交。

PrimerBank：https://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/

3、引物序列输出

最后输出确认基因信息，然后选择多对引物供。