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（Dot Blot Analysis of N⁶-methyladenosine RNA Modification Levels
N6-甲基腺苷RNA修饰水平的斑点印迹分析）

简介

N⁶ -甲基腺苷（m⁶A）是真核信使RNA（mRNA）的最普遍的内部修饰。可以通过几种方法检测m⁶A的总量，例如使用特异性m⁶A抗体的斑点印迹分析和定量液相色谱 – 串联质谱（LC- MS / MS）（Fu等人，2014; Shen等人，2016）。在这里，我们描述使用特异性m⁶A抗体通过斑点印迹分析来快速检测mRNA中的总m⁶A水平的方法。

背景 与其他方法（如二维薄层色谱和LC-MS / MS）相比，mRNA检测的斑点印迹分析相对容易，快速，经济有效。这种方法可以以定性的方式用于评估在不同发育阶段的各种植物组织或植物中的m⁶A水平的时间和空间变化。这对于通过其他复杂和定量方法进行详细调查之前初步检查相关突变体中m⁶A水平的变化特别有用。

关键字：斑点印迹, RNA修饰, N6-甲基腺苷

材料和试剂

1. Amersham Hybond-N +膜（GE Healthcare，目录号：RPN203B）
2. 保鲜膜
3. Amersham Hyperfilm ECL（GE Healthcare，目录号：28906835）
4. 总RNA
5. Dynabeads ^® mRNA纯化试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Ambion ^TM，目录号：61006）
6. 无RNase的水
7. 抗 – 抗体（Synaptic Systems，目录号：202 003）
8. 山羊抗兔IgG-HRP（Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc-2004）
9. ECL Western Blotting Substrate（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM ，目录号：32106）
10. 1×磷酸缓冲盐水（1×PBS），pH7.4
11. 吐温20（Sigma-Aldrich，目录号：P9416）
12. 不含脂肪的牛奶（Bio-Rad Laboratories，目录号：1706404）
13. 洗涤缓冲液（见配方）
14. 阻塞缓冲区（见配方）
15. 抗体稀释缓冲液（见配方）

设备

1. NanoDrop 2000分光光度计（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，型号：NanoDrop TM 2000/2000分光光度计）
2. 热块
3. Stratalinker 2400紫外线交联剂（Stratalinker）
4. 振动器

软件

1. ImageJ

程序

1. mRNA纯化
   1. 使用Dynabeads mRNA纯化试剂盒按照制造商的说明书从总RNA中分离mRNA。对于一个斑点印迹测定，我们建议纯化至少20μg的总RNA。
   2. 用NanoDrop确定纯化的mRNA的浓度，并使用无RNase的水进行mRNA的连续稀释至50 ng /μl，10 ng /μl和2 ng /μl。
2. 斑点印迹
   1. 在95℃下使连续稀释的mRNA变性以破坏热块中的二级结构3分钟。
   2. 变性后立即在冰上冷却，以防止mRNA的二级结构重新形成。
   3. 将2μl的mRNA直接滴加到用于核酸转移优化的Hybond-N +膜上（图1）
      
      图1.膜上mRNA点的实例
      
   4. 交联通过自交联模式（1,200微焦[x100]; 25-50秒），在Stratalinker 2400紫外线交联剂中将膜上的膜分成两层。
   5. 将清洁的洗涤盘中的10毫升洗涤缓冲液中的膜在室温下清洗5分钟，清洗不需要RNase的洗涤盘，轻轻振荡洗涤未结合的mRNA。
   6. 在室温下温和摇动，将膜在10ml封闭缓冲液中孵育1小时。
   7. 将抗体（1:250稀释;2μg/ml）在抗体稀释缓冲液中于4℃温和摇动过夜孵育膜。
   8. 每次洗10分钟洗涤缓冲液，轻轻摇动膜3次，每次洗涤5分钟。
   9. 使用山羊抗兔IgG-HRP（1：10,000稀释; 20ng/ml）在10ml抗体稀释缓冲液中在室温下温和摇动孵育膜1小时。
   10. 每次洗10分钟10分钟洗涤缓冲液，轻轻摇动膜。
   11. 在室温下在黑暗中将3ml ECL Western Blotting底物孵育5分钟。请注意，添加的ECL溶液的体积取决于膜的尺寸。根据制造商的说明书，推荐使用0.125ml ECL溶液/cm 2。
   12. 将膜包裹在塑料包装中，并用超薄膜ECL曝光适当的曝光期。
   13. 制作电影

数据分析

斑点印迹分析是半定量方法，应用独立生物材料通过上述步骤重复分析。与野生型对照相比，在独立材料中观察到的m ⁶ A水平的可重复变化被认为是”阳性”结果，可以通过其他定量方法进一步研究。此外，斑点印迹图像的信号可以通过ImageJ进行定量，统计分析应至少基于三个生物重复。

代表数据

有关代表性的数据，请参见Shen 等人的论文，2016年。

笔记

如果相应的特异性一级抗体和二级抗体可用，该方案也适用于检测其他类型的RNA修饰。

食谱

1. 洗涤缓冲液
   1x PBS
   0.02％吐温-20
2. 阻塞缓冲区
   1x PBS
   0.02％Tween-20
   5％无脂牛奶
3. 抗体稀释缓冲液
   1x PBS
   0.02％Tween-20
   5％无脂牛奶

注意：无需使用无RNase的水来准备上述解决方案。

致谢

这项工作得到了新加坡教育部新加坡国家研究基金会调查计划（NRF-NRFI2016-02）的学术研究基金（MOE2015-T2-1-002）和新加坡国立大学的校内研究支持和淡马锡生命科学实验室。

参考文献

1. Fu，Y.，Dominissini，D.，Rechavi，G.，and He，C.（2014）。  通过可逆的m6A RNA甲基化介导的基因表达调控。 Nat Rev Genet 15（5）：293-306。
2. Shen，L.，Liang，Z.，Gu，X.，Chen，Y.，Teo，ZW，Hou，X.，Cai，WM，Dedon，PC，Liu，L。和Yu，H。（2016） 。 N6-甲基腺苷RNA修饰调节芽干细胞命运拟南芥。 Dev Cell 38（2）：186-200。