RNA甲基化（RNA methylation）是一类表观遗传修饰，在已经发现的超过100种不同的RNA化学修饰中，主要有6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenosine, m6A）、5-甲基胞嘧啶（C5-methylcytidine, m5C）和1-甲基腺嘌呤（N1-methyladenosine, m1A）。RNA 甲基化在调控基因表达、编辑、稳定性及降解等方面扮演重要角色。早在20世纪70年代，人们已经在真核生物的mRNA和lncRNA中发现了m6A修饰。但受制于技术的局限性，无法开展m6A检测尤其是m6A定量分析，甚至是单碱基水平m6A的鉴定。随着高通量测序技术（NGS）的发展以及液相色谱灵敏度的提高，RNA甲基化整体水平的鉴定方法得到了长足的发展。

目前RNA甲基化整体水平的鉴定所用的技术手段包括液相色谱联用（LC-MS）、比色法以及Dot blotting等。下面就分别来介绍目前较为流行的RNA甲基化整体水平的鉴定方法。

图1. RNA甲基化的主要类型

1. LC-MS/MS

LC-MS/MS在液相质谱的基础上采用串联质谱，能够获得分子离子峰和碎片离子峰，可对碱基同时进行定性和定量分析。第一步使用TRIzol提取完Total RNA后，对mRNA进行富集并去除rRNA。第二步是在37℃条件下，将200-300 ng mRNA用含有25 mM NaCl和2.5 mM ZnCl2缓冲液的核酸酶P1（2 U）消化2 h，然后加入NH4HCO3（1 M，3 μl）和碱性磷酸酶（0.5 U），37℃再孵育2 h后，将RNA从单链消化成单个碱基。第三步将样品稀释至50 μl并过滤，并将5 μl溶液注入LC-MS/MS中，根据出峰的保留时间面积计算各个碱基的含量。第四步进入质谱串联分析，单个核糖核苷酸会被离子化，同时被打断成五碳糖和嘧啶或嘌呤，在C18柱上通过反相超高效液相色谱分离核苷，使用Agilent 6410 QQQ三重四极杆LC质谱仪以正电喷雾电离模式进行质谱检测，根据出峰的保留时间计算m6A的面积。最后根据m6A和总A的比例就能算出m6A在mRNA上整体的甲基化程度。

图2. LC-MS/MS检测RNA甲基化水平示意图

2. 比色法

    比色法RNA甲基化整体水平鉴定也是我们云序生物的一款产品。相对于LC-MS/MS较为繁琐的操作，比色法更为简便。m6A定量检测试剂盒（比色法）提供了所有定量检测总RNA中m6A试剂。在这个分析试剂盒中，采用类似于ELISA抑制竞争免疫的方法，样本和m6A标准品首次与m6A抗体溶液被孵育；然后转移到包被有m6A多核苷酸的条孔上。在孵育之后孔可以洗脱任何未包被的试剂然后添加检测抗体生成信号，通过微孔板读取仪（如：酶标仪）来检测。因为在样本的m6A抑制了m6A抗体与涂抹在孔上m6A的结合，样本中更高浓度导致与在孔中的m6A结合减少。因此，从孔总测的信号或OD参数与样本中m6A的数量成反比。并且样本中m6A的量可以通过预先设定的m6A标准品来实现定量检测。

图3. 比色法定量检测m6A甲基化的操作步骤

3. 荧光法

m6A RNA甲基化定量检测试剂盒（荧光法）提供了所有定量检测总RNA中m6A的必要试剂。在这个分析试剂盒中，使用高效RNA结合液将总RNA绑定在孔板上。使用捕获和检测抗体对m6A进行检测。随着信号的增强然后使用荧光分光光度计读取RFU（relative fluorescence units）吸光值。m6A的量与测量的荧光单位成比例。

图4. 荧光法定量检测m6A RNA甲基化的步骤

4. Dot blotting

与其他方法相比，如二维薄层色谱和LC-MS/MS等，使用Dot blotting检测mRNA中m6A甲基化总体水平的方法相对简单、快速且成本较低。第一步是总RNA的提取，使用Dynabeads® mRNA Purification Kit分离出mRNA，采用NanoDrop方法检测mRNA的纯度，并稀释成不同的浓度。第二步Dot blotting，在95℃的高温下将连续稀释的mRNA变性。在变性后立即冷却，以防止mRNA的二级结构的重新形成。将2 μl的mRNA直接转移至经核酸优化的尼龙薄膜上。在特定条件下进行自动交联，采用温和的方式洗去未结合的mRNA并过滤。在4℃、温和震荡的条件下，用抗m6A的抗体10 ml稀释缓冲液孵育薄膜。在温和震荡的条件下，用10 ml的洗涤缓冲液对薄膜清洗3次，每次5 min。用羊抗兔IgG-HRP（1:10000稀释，20 ng/ml）在室温下孵育尼龙薄膜。用10 ml的洗涤缓冲液洗涤薄膜，每10 min清洗一次，每次清洗10min。在黑暗室温下，使用3 ml的Western Blotting Substrate孵育尼龙薄膜。封膜处理后，用超薄膜ECL进行曝光，以获得适当的曝光时间，最后显影观察。

图5. Dot blotting操作步骤示意图

RNA甲基化整体水平的鉴定今天就讲完啦，大家记得收藏学习哦~