你是否发现非编码RNA（Non-coding RNA）的研究越来越火热？当一个新发现的miRNA是否对相关疾病有较显著的调控作用，这就需要我们先对它和靶基因的调控关系做一验证，接下来我们就介绍最常用的靶向关系验证方法：双荧光素酶报告基因检测。
一. 检测原理
由于miRNA主要通过作用于靶基因的3’UTR起作用，可以将目的基因3’UTR区域构建至载体中报告基因luciferase的后面， 通过比较过表达或者干扰miRNA后，报告基因表达的改变（监测萤光素酶的活性变化）可以定量反映miRNA对目的基因的抑制作用；结合定点突变等方法进一步确定miRNA与靶基因3’UTR的作用位点。
双荧光素酶报告基因检测系统示意图
二. 实验材料
仪器设备：荧光显微镜、CO2培养箱、生物安全柜、低速离心机、 血球计数板 、水浴锅、酶标仪；
统计学处理：GraphPad Prism作图
三. 实验步骤
主要分为：质粒转染细胞→双报告基因检测→统计学分析。
质粒转染细胞：
1、细胞铺板：将细胞按70%的汇合度接种到96孔板。
2、转染：16小时后转染萤光素酶报告基因质粒和RNA，每个样品设置6个复孔。 1) 配制DNA和转染试剂: 96孔板转染质粒时每孔比例Firefly：Renilla：转染试剂=0.1μg：0.01μg：0.25μl； 2) 配制RNA和转染试剂稀释液，RNA的终浓度为100nM，转染试 剂每孔0.25μL； 3) 稀释好的DNA和RNA及转染试剂，常温孵育5min； 4) 将稀释好的DNA和RNA分别和转染试剂混匀，常温孵育20min； 5) 每孔弃去50ul培养基，将25μL DNA转染混合液和25uL RNA转 染混合液分别添加到每孔细胞样品中； 6) 转染6小时后，换新鲜完全培养基。
双报告基因检测：
1、质粒共转染48小时后，弃去培养基，用100μl 1XPBS洗1遍； 2、 倾斜96孔板，吸干剩余的PBS； 3、去离子水将5XPLB稀释成1XPLB，使用前放到常温； 4、每孔加50μl稀释好的 1X PLB，摇床常温条件下摇15min，进行裂 解； 5、白色不透光的96孔酶标板中每孔加步骤4的上清液10μl， 加入100 μl预先混好的LAR II，2s后测数据； 6、每孔添加100μl预先混好的Stop&Glo Reagent，静止2s后，测数 据 注意：进行Luciferase活性检测时，需在避光条件下进行。