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众所周知,研究非编码RNA必定要对LncRNA/circRNA进行亚细胞定位,研究非编码RNA亚细胞定位的方法有:荧光标记探针进行原位免疫荧光(FISH)、分离胞浆和胞质的RNA进行PCR检测。当然经费充足的话FISH是首选,即可定性也可定量,还有细胞照片,可信度最高。但是实验室没这条件,外包不放心还死贵。所以我选择后者。

目前已知的分离胞浆和胞质的RNA的标准方案有:Ambion® PARIS™ Kit (Catalog number: AM1921)和Norgen Biotek公司Cytoplasmic & Nuclear RNA Purification Kit (NGB-21000)。以上两种试剂盒都是有大量文献使用的,但是价格较贵(约4500块/50T)。廉价替代方案还是有的:碧云天P0028+RNase Inhibitor (参考帖子https://www.dxy.cn/bbs/newweb/pc/post/31149116

碧云天P0028是用来抽提胞浆和胞核蛋白质的,但是咨询技术后我得知试剂盒中不含有破坏RNA的组分,目前确立了如下Protocol:

  • 所需仪器、用品与试剂:

细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒(Beyotime P0028)、RNase Inhibitor(Beyotime R0102)、Trizol试剂、无酶EP管、移液枪、无酶枪头等

  • 操作步骤:

1. 准备溶液:使用前从-20℃冰箱取出P0028试剂盒,室温融解试剂盒中的细胞浆蛋白抽提试剂A和细胞浆蛋白抽提试剂B,溶解后立即放置在冰上,混匀。取适当量的细胞浆蛋白抽提试剂A备用,在使用前数分钟内加入RNase-free Water稀释的RNase Inhibitor,使其最终浓度为1-2U/µl。(所有试剂置于冰上备用)

2. 对于贴壁细胞:用PBS清洗一遍,胰酶消化细胞,并计数。低速离心收集细胞,弃培养基,PBS洗一遍,低速离心收集细胞,尽最大努力吸尽上清,留下细胞沉淀备用。(置于冰上)

3. 对于悬浮细胞:细胞计数后用PBS洗一遍,离心收集细胞,尽最大努力吸尽上清,留下细胞沉淀备用。(置于冰上)

4. (冰上操作)每20μL细胞沉淀加入200μL添加了RNase Inhibitor(含未稀释的R0102 10μL)的细胞浆蛋白抽提试剂A。(对于二百万HeLa细胞,其细胞沉淀的体积大约为20μL或40mg。)

5. Vortex 5秒,把细胞沉淀完全悬浮并分散开。(如果细胞沉淀没有完全悬浮并分散开,可以适当延长vortex时间。)

6. 冰浴10~15min。

7. 加入细胞浆蛋白抽提试剂B 10μL。Vortex 5秒,冰浴1分钟。

8. Vortex 5秒,4ºC 12000g离心5分钟。

9. 立即吸取上清至一预冷的塑料管中,加入Trizol抽提细胞浆RNA。(千万不要触及沉淀,可以在沉淀上方保留极小体积的上清,以免触及沉淀。)

10. 对于沉淀,完全吸尽残余的上清,加入Trizol抽提细胞核RNA。

11.以下步骤同Trizol法提取总RNA。

RNA抽提质量评估:

1.RNA浓度:A260 x dilution factor x 40= μg RNA/mL;

(1 A260= 40 μg RNA/mL)

注意DNA污染,否则A260吸光值增加。

2.RNA产量:标本不同,产量相对也不同。但基本产量范围是固定的。

105的细胞=1 μg,1mg组织=1~10 μg

3.RNA纯度: A260:A280=1.8-2.1

4.1%琼脂糖凝胶电泳UV成像观察条带:胞浆可见明显28S/18S 双条带,亮度略低于总RNA,而胞核双条带亮度很低。

下图为标准方案中的PARIS试剂盒提取质检图(变性琼脂糖凝胶电泳)

C:\Users\JinWa\AppData\Local\Temp\1621320905(1).png

T  total    C  cytoplasmic   N   nuclear

国产替代方案RNA提取后质检参考图片:

等做完实验加上图

强烈建议抽提之后进行电泳评估抽提质量后再进行PCR操作。

核质分离实验注意事项:

1、核质一定要分离干净,吸取胞浆上清的时候一定不要吸到沉淀,同样地,对于沉淀,要完全吸尽残余的上清(吸到沉淀无影响)。

2、无论什么方法分离必定有损耗,所以不用纠结。

3、RT-PCR加样时务必保证加入了等量的胞浆RNA和胞核RNA,这样才能使用简化公式。

4、使用最优引物保证在较大浓度范围内扩增效率接近100%,否则不能使用简化公式。

结果分析方法(简化公式):

核%=2^-胞核CT值/(2^-胞浆CT值+2^-胞核CT值)

质%=1-核%

公式原理:本人称之为假定内参法

假设有基因Z,基因Z在胞浆和胞核中各占比50%,同时取1000ng胞浆RNA和胞核RNA进行逆转录得到cDNA,在用此cDNA进行PCR(不稀释或者稀释同等倍数),那么PCR得到胞浆RNA和胞核RNA的基因Z的CT值必定一样(显而易见么,加样时基因Z的模板量一样,其他条件相同),我假设CT值都是15,而GAPDH的CT值,胞浆14,胞核16,那么以胞核GAPDH的相对表达量为1,胞浆GAPDH的相对表达量用2^-ΔΔCT 计算就是4,最终得到GAPDH的质%为80%,核%为20%。

同样的,以目标基因Y在胞核的相对表达量为1,目标基因Y在胞浆的相对表达量计算结果就是

实际操作:

1、导出PCR结果CT值到Excel

2、按简化公式计算对应比例

C:\Users\JinWa\AppData\Local\Temp\1621325106(1).png

3、结果导入GraphPad画图

C:\Users\JinWa\AppData\Local\Temp\1621325125(1).png

新建数据,选择Grouped,3个重复

C:\Users\JinWa\AppData\Local\Temp\1621325147(1).png

把Excel计算好的结果数值复制过来

C:\Users\JinWa\AppData\Local\Temp\1621325218(1).png

选择二维分组柱状图

本文参考:https://www.dxy.cn/bbs/newweb/pc/post/31149116

50 Replies to “核质分离检测LncRNA/circRNA的亚细胞定位”

  1. 请问这个U6内参引物设计还有特殊的地方么,我有同学做micro用的是U6内参,可以拿来直接用么?另外那个RNA inhibitor的剂量具体是多少呢,前面说是稀释到1-2U/ul,后面又变成未稀释的原液10ul了,一瓶2000U的只有40ul的量,买一管只能做4个样本了。。

    1. U6我网站上有序列:https://www.jingege.wang/2022/08/03/%e4%ba%ba%e5%92%8c%e5%b0%8f%e9%bc%a0u6%e5%92%8ch1%e5%90%af%e5%8a%a8%e5%ad%90%e5%ba%8f%e5%88%97%e5%8f%8aqpcr%e5%bc%95%e7%89%a9/,至于抑制剂,参考说明书使用量加入,不同厂家有区别

  2. 下面的内容也是抄袭的b站一位up主的,和丁香园那个是同一个人

    1. 谢谢提醒,最下面有注明来源的,这个网站主要是我的个人笔记,顺便方便大家一起学习。转载的内容一般都会注明来源

  3. 您好,我想问一下步骤中有一个加入200ul含RNase inhibit 的试剂A,到底含有多少A试剂呢,前边不是说要把RNase inhibit稀释到1-2u/ul,有点没搞懂具体的试剂添加情况

  4. 进哥你好。请问第九步和第十步,加入Trizol后体积是不同的。假设加入500ulTrizol,胞质的体积更多。这个会影响最终结果吗?

    1. 你好,这个全程最好保证胞质和核提取逆转录 qPCR步骤一致,你说的是胞质是液体,相对核体积更大,那这样同样的trizol下会不会有影响,这个的话可以使用多一点的trizol,一般1ml也够了,多一点会更好

      1. 谢谢回复。还有个疑问,使用碧云天试剂盒裂解细胞后,沉淀是细胞核。拿Trizol很难裂解呀,很暴力才行,不知这个对最终结果有无影响,我做了一次,因为胞质离心时震出来一些,结果不准确。不过感觉有戏

          1. 问题解决了吗?我们现在也是感觉Trizol裂解不开

  5. 进哥你好。请问第九步和第十步,加入Trizol后体积是不同的。假设加入500ulTrizol,胞质的体积更多。这个会影响最终结果吗?

  6. 请问18S在细胞质内比例是90%+,但是U6在核质内各占一半是什么原因呢,是细胞核泄露吗?

      1. 你好,重复了一次,结果还是一样不成功,18s在细胞核的比例3%,细胞质中97%,U6在细胞核中65%,细胞质中35%,我用的是Norgen的试剂盒分离的,请问是什么原因呢进哥哥

        1. 请问你用norgen试剂盒,吸上清的时候,会不会容易吸到底下粘稠的核RNA啊,我试了好多次都会吸到,请问怎么解决呢

  7. 王博,想请问一下,我最近在做核质分离实验,最近一次结果显示U6在核、质分布差不多,GAPDH在核里面0.7,冰浴时间25分钟左右,细胞数大概6百万;trizol提核的时候只加了1ml,最后浓度检测质的浓度有一千多,核的一百多。想请问一下我可以从哪里改进一下?

    1. 你好,这个猜测可能是分离细胞浆时有核污染,可能是涡旋过于剧烈 也有可能是冰浴时间过长,建议从这两个操作进行优化

      1. 请问一下,我做出来了和例子中同样的结果,请问这算成功了吗! 质内参基因在细胞质中的表达量比在细胞核中高不了多少,这算成功吗!

        1. 大不了多少是多少?尽量差的大一点更好。在于裂解和吸取上清的步骤
          重点是核RNA(例子中是NEAT1,也可U6等)那个比例一定要高,因为质中肯定没有,而质RNA是在核中转录 也会存在

  8. 进哥我想问下 我的lncrna u6 都是在核中都是0.7左右,但是actin都是0.6左右这是什么原因呢,是不是因为actin不太适合作为胞质内参用gapdh好一点?

      1. 进哥那你觉得在哪里改进下比较好呢比如第六步我是冰浴15分钟改为30分钟可以吗

          1. 进哥!我做成果了! 感谢感谢你太厉害了?

          2. 进哥我还有一个问题就是这种pcr 的话是分别做三次统计呢,还是做一次用三个复孔统计就行

          3. 哈哈 这个问题其实和做其他实验一样,严格来说你三个复孔的数据仅仅是技术平行,而非生物平行;而所谓三次结果 指的是生物平行。
            这个是严格要求上,具体如何看你自己了

        1. 你好,我想请教一下,我提完以后qPCR结果显示U6在核和质分布差不多,GAPDH在核反而多一点,冰浴时间我大概花了二十多分钟。想问一下我应该在哪里改进比较好?

        2. 老哥你改动的地方多吗,只有你说的15min增加为30min?还是有其他变动得地方,能说一下吗,我这边还是不成功,已经重复做了好多词了,谢谢

  9. 进哥,感谢分享,国产的替代方案效果怎么样哇,能做小RNA吗,你的国产质检图是不做完忘了上了

  10. 进哥你好,我是苏大附一院的21级学生,我得到的结果发现,GAPDH和U6以及目的lncRNA都是在细胞核中比例非常高,大于0.9的样子,请问你知道这是怎么回事吗,谢谢您

    1. 您好 不好意思 这两天忙着写标书 没时间看网站留言
      这个没什么其他怀疑的 就是第一步裂解不充分,导致全部细胞成分都沉淀下去,作为细胞核进行后续操作了

  11. 您好,我分离完成之后按照同质量进行qPCR实验,GAPDH和U6全部都集中在细胞核中表达,同样的样品我进行westron blot验证分离的没有问题,但是提取的质RNA的总量有核RNA的3、4倍,想知道问题出在什么地方。

  12. 我的核质分离之后,GAPDH和U6在细胞质和细胞核中各占一半呀,请问这个是因为细胞核有细胞质的污染吗?怎么解决呀?

    1. 你好 各占一半。。。那就是说明没有分离成功,已经不是单纯的没有吸干净导致的污染。你确认一下实验步骤,只能重新用细胞提取

  13. 进哥你好 请问如果想要分析一种mRNA的胞核胞质分布情况,胞核胞质的内参选择不一样的话还能进行比较吗?

    1. 您好,实际上这个分析的时候并不是和一般qPCR分析用的2^(-△△Ct),本文中有介绍计算方法。用到的GAPDH/U6在这里是作为细胞质和细胞核的标志分子,用以验证核质分离的可信度

      1. 请问进哥哥之前有用过这个U6的小鼠序列么?我用常规的primerbank找这个序列并没有找到primer。可否能推荐一个序列呢?

  14. 如果同时加入RNase Inhibitor和PMSF,可以同时提取胞核胞质的RNA和蛋白吗…

    1. 当然可以,按照共提的流程提取上清RNA和蛋白,完全可以,就是麻烦了。如果样本不是很珍贵,没有必要这样

  15. 请问碧云天这个试剂盒是不是不能像PARIS那样同时提取胞核胞质的RNA和蛋白呀

    1. 这个试剂盒仅仅能够做到分离细胞核和细胞质,还要结合共提试剂盒,才可以完成提取步骤

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