检测甲基化状态的方法比较多，目前被认为金标准的是亚硫酸盐的测序法（bisulfite sequencing PCR,BSP）。
BSP原理
用亚硫酸氢钠修饰处理基因组DNA，所有未发生甲基化的胞嘧啶（C）被转化为尿嘧啶（U）而甲基化的胞嘧啶则不变。
基因组DNA经亚硫酸盐处理后，设计BSP引物扩增目的片段，此时尿嘧啶（U）全部转化为胸腺嘧啶（T），最后对PCR产物进行测序就可以判断CpG位点是否发生甲基化。
BSP实验流程:
DNA抽提和亚硫酸盐处理都可参考相应的试剂盒进行操作
引物设计网站网址如下：http://www.urogene.org/cgi-bin/methprimer2/MethPrimer.cgi
网址引物设计界面如上图，可选择设计什么类型的引物，此处选择设计BSP引物。
该网站可提供CpG岛的预测等功能，所以可选择通过预测CpG岛后用于引物设计的选项，如下图：
其他参数选择默认值即可，仍以人的GAPDH启动子序列为例
设计结果如上，预测到有2个CpG岛，根据测的结果反馈设计的引物如上图
另外可根据自己的需要调整引物设计的相关参数，如下图
另外预测结果中还给出了亚硫酸盐处理前后序列的变化情况、引物对应的位置以及CpG位点的位置情况：
另外在设计引物中还有相关注意事项：
用于BSP实验的DNA是经过亚硫酸盐处理，将未甲基化的C碱基转变为U碱基，而甲基化的C碱基不变，从而将甲基化的差异转变成碱基上的差异，所以在后续进行PCR扩增引物设计的时候需要注意：
1、引物设计不能含有CpG位点，以避免造成发生甲基化和未发生甲基化DNA的差异。
2 、引物扩增的片段能包含尽量多的CpG位点，BSP扩增片段长度300-500bp，包含的CpG位点越多则引物的打分越高。
BSP引物设计完成后应进行PCR扩增直接测序或者通过TA克隆测序分析甲基化频率。
BSP直接测序结果
BSP点状图
空点表示为未发生甲基化的CpG位点，实点表示发生甲基化的CpG位点
BSP柱状图
您好，亚硫酸盐处理前采用物理破碎DNA后在转化，最后得到的文库峰图有拖尾现象是什么情况呢？是PCR循环多了吗？input DNA投入100ng，建库的。
您好，我想问一下亚硫酸氢盐处理后的DNA 对于某个基因某个片段进行测序发现有的C全部未转化，有的序列C是部分转化为T，而有的是全部转化为T，我这边认为全部没转化的可能是高甲基化也可能是DNA没处理完全的问题，而这种全部转化为T的就是甲基化程度低吗？还是说会有其他原因导致的呀？
同一片段，甲基化程度高的测序测通了，甲基化程度低的测到中间断了（只要甲基化程度低的都这样），这是什么原因呢
老师好，您觉得BSP引物设计好后有必要用blast检测特异性吗？普通PCR+琼脂糖凝胶跑一下看看条带位置即可吗
你好，看文献里面计算单基因甲基化水平，做的柱状图。请问根据单克隆测序序列，可以用哪个网站或者软件计算甲基化水平，分CG，CHG和CHH，然后再作图。
进哥哥，BSP引物设计完成后应进行PCR扩增直接测序或者通过TA克隆测序分析甲基化频率。这两种测序方式有对结果的影响大不？
请问有bsp法测序出来结果，进行数据分析，计算甲基化程度的网址吗？之前用的那个不能用了
老师您好，请问BSP作为半定量法，挑菌测序需要挑菌多少个比较合适呢？我看有人说至少20个才能保证准确。
分析是用R分析吗？
老师，您好，我这边将样本进行亚硫酸氢盐处理之后pcr条带不明显，未处理的pcr之后条带比较亮
重亚硫酸盐处理之后会损失不少，如果确定有条带，可以增加循环数，没有的话就重新设计引物
老师，您好，我将未进行亚硫酸氢盐处理的DNA样本和亚硫酸氢盐处理后的DNA样本进行pcr，电泳条后都有条带，只是未处理的条带比较亮
你好，不好意思 刚刚看见，可能由于之前迁移服务器的原因导致的，其实还是可以显示的 右击那个没有显示的小方格，加载映像即可
当然 我看看能否修复一下
这个方法羟甲基化的胞嘧啶也会保持不变吗？5mc，5hmc，5fmc都会被识别成5mc？
你好，羟基化和甲基化（5mc，5hmc）都不会被转化，5fC和没有任何修饰的C就被转化成U
您好，请问如果是TA克隆测序，根据测序结果，怎么分析三种环境的甲基化水平呢，或者总甲基化水平，想用柱状图分析，类似定量的方式
可以的 有专门的用于BSP seq的R语言分析包，可以做到半定量，我抽空做个小程序分享给大家
好的，是不是可以根据测序序列，看碱基的变化来统计发生甲基化位点
可以的
请问根据测序序列，怎么统计分析甲基化水平啊，可以出一片关于bsp数据分析的文章吗（根据他人的文献）
OK，最近有空整一下，也抽空做个小程序进行分析
您好，麻烦问一下你亚硫酸氢盐处理的DNA样本pcr后电泳条带和未处理的DNA样本pcr电泳条带之间有什么不同吗
你好，请问这高小程序的名称是什么？在你的主页中搜索不到。
重亚硫酸盐转换后的DNA跑胶为什么会没条带？
重亚硫酸盐处理之后DNA会被破坏打断，所以原来基因组的那一条带不会存在 在低分子量位置有弥散条带就是处理之后的
如果进行过了WGBS的话，DMR在该基因的外显子和内含子上，那么这个DMR如何验证呢，DMR在内含子上的话，这个基因是否有关注的必要呢，麻烦老师了
您好，对于确定位点的验证，建议BSP测序验证，比较简单直接；
内含子区可能价值不大，最好还是启动子区的，减少试错可能性，当然时间足够可以同时做做
非常感谢您的答复
麻烦问一下后续的分析图是从那个网站分析的，谢谢。
点状图吗 一个比较老的软件BiQ_Analyzer
很全面！