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检测甲基化状态的方法比较多,目前被认为金标准的是亚硫酸盐的测序法(bisulfite sequencing PCR,BSP)。

BSP原理

用亚硫酸氢钠修饰处理基因组DNA,所有未发生甲基化的胞嘧啶(C)被转化为尿嘧啶(U)而甲基化的胞嘧啶则不变。

基因组DNA经亚硫酸盐处理后,设计BSP引物扩增目的片段,此时尿嘧啶(U)全部转化为胸腺嘧啶(T),最后对PCR产物进行测序就可以判断CpG位点是否发生甲基化。

 

BSP实验流程:

DNA抽提和亚硫酸盐处理都可参考相应的试剂盒进行操作

引物设计网站网址如下:http://www.urogene.org/cgi-bin/methprimer2/MethPrimer.cgi

网址引物设计界面如上图,可选择设计什么类型的引物,此处选择设计BSP引物。

该网站可提供CpG岛的预测等功能,所以可选择通过预测CpG岛后用于引物设计的选项,如下图:

其他参数选择默认值即可,仍以人的GAPDH启动子序列为例

设计结果如上,预测到有2个CpG岛,根据测的结果反馈设计的引物如上图

另外可根据自己的需要调整引物设计的相关参数,如下图

另外预测结果中还给出了亚硫酸盐处理前后序列的变化情况、引物对应的位置以及CpG位点的位置情况:

另外在设计引物中还有相关注意事项:

用于BSP实验的DNA是经过亚硫酸盐处理,将未甲基化的C碱基转变为U碱基,而甲基化的C碱基不变,从而将甲基化的差异转变成碱基上的差异,所以在后续进行PCR扩增引物设计的时候需要注意:

1、引物设计不能含有CpG位点,以避免造成发生甲基化和未发生甲基化DNA的差异。

2 、引物扩增的片段能包含尽量多的CpG位点,BSP扩增片段长度300-500bp,包含的CpG位点越多则引物的打分越高。

BSP引物设计完成后应进行PCR扩增直接测序或者通过TA克隆测序分析甲基化频率。

BSP直接测序结果

BSP点状图

空点表示为未发生甲基化的CpG位点,实点表示发生甲基化的CpG位点

BSP柱状图

22 Replies to “亚硫酸盐的测序法(bisulfite sequencing PCR,BSP)”

  1. 你好,看文献里面计算单基因甲基化水平,做的柱状图。请问根据单克隆测序序列,可以用哪个网站或者软件计算甲基化水平,分CG,CHG和CHH,然后再作图。

  2. 老师,您好,我这边将样本进行亚硫酸氢盐处理之后pcr条带不明显,未处理的pcr之后条带比较亮

    1. 重亚硫酸盐处理之后会损失不少,如果确定有条带,可以增加循环数,没有的话就重新设计引物

  3. 老师,您好,我将未进行亚硫酸氢盐处理的DNA样本和亚硫酸氢盐处理后的DNA样本进行pcr,电泳条后都有条带,只是未处理的条带比较亮

    1. 你好,不好意思 刚刚看见,可能由于之前迁移服务器的原因导致的,其实还是可以显示的 右击那个没有显示的小方格,加载映像即可
      当然 我看看能否修复一下

  4. 这个方法羟甲基化的胞嘧啶也会保持不变吗?5mc,5hmc,5fmc都会被识别成5mc?

  5. 您好,请问如果是TA克隆测序,根据测序结果,怎么分析三种环境的甲基化水平呢,或者总甲基化水平,想用柱状图分析,类似定量的方式

    1. 可以的 有专门的用于BSP seq的R语言分析包,可以做到半定量,我抽空做个小程序分享给大家

      1. 好的,是不是可以根据测序序列,看碱基的变化来统计发生甲基化位点

          1. 请问根据测序序列,怎么统计分析甲基化水平啊,可以出一片关于bsp数据分析的文章吗(根据他人的文献)

        1. 您好,麻烦问一下你亚硫酸氢盐处理的DNA样本pcr后电泳条带和未处理的DNA样本pcr电泳条带之间有什么不同吗

    1. 重亚硫酸盐处理之后DNA会被破坏打断,所以原来基因组的那一条带不会存在 在低分子量位置有弥散条带就是处理之后的

  6. 如果进行过了WGBS的话,DMR在该基因的外显子和内含子上,那么这个DMR如何验证呢,DMR在内含子上的话,这个基因是否有关注的必要呢,麻烦老师了

    1. 您好,对于确定位点的验证,建议BSP测序验证,比较简单直接;
      内含子区可能价值不大,最好还是启动子区的,减少试错可能性,当然时间足够可以同时做做

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