之前已经介绍过Snapgene的安装与使用，我们在进行分子生物学设计的时候经常用到这个工具：

这样：

还有这样：

下面介绍一下如何利用SnapGene设计SNP位点的RFLP检测和扩增测序方案：

序列获取

软件给出的结果一般都是以下形式，给出的只有突变所在基因组位置或者区间信息。

那么该怎么去设计PCR验证实验的引物呢？

首先，我们这里对snv取鉴定到的位点的上下游各400bp，indel的话是区间位置的上下游200-300bp。
拿上图的snv举例，它的Start和End分别是48556379和48556379，那么各加400bp，则位置变为：48555979和48556779。同时要注意这里注释出来时ABBCA13这个基因。
那么接下来就先在NCBI的Nucleotide数据库检索这个基因：

然后选择第一个检索出来的GENE的链接：

再把页面下拉到“Genomic Regions, transcripts, and products”这边，点击右边的“FASTA”

这时候可以看到右边有一个”Selected region”

最后再把刚才取好的上下游400bp扩展后的基因组位置输入到这个区间，就得到这段的序列了，然后根据序列使用Primer premiere设计验证引物即可。

扩增出序列之后进行Sanger测序，验证SNP或Indel位点。

RFLP检测

RFLP是指DNA片段的限制性酶切片段多态性，SNP的限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism,缩写RFLP)检测流程如下：

1.        选择合适的限制性内切酶，该酶能够特异性识别SNP位点的碱基种类，当SNP位点碱基变化时，能够使该酶失去原有的识别位点；

2.        设计扩增引物，将包含SNP位点的一段DNA扩增下来，且保证其中只有一个该酶的识别位点；

3.        使用限制性内切酶对产物进行酶切、电泳，通过产物带型来确定SNP的碱基种类。

因此，该方案的核心有两个：限制性内切酶的选择及扩增引物的设计。

一、 限制性内切酶的选择

由于SNP位点出现的随机性，很难一眼就看出该序列位于什么酶的识别位点，而使用SnapGene软件，就非常容易了。

举个例子，检测RS2267668 [A/G]多态性：

【1】将SNP位点分别设置为A和G，得到两条序列，将序列都放入SnapGene，开启左上角酶切位点按钮，建议最初选择所有的（All Commercial）

【2】 对比两者，发现当SNP位点碱基为G时，多出一个酶切位点：Hpy188I。这就意味着，可以使用该酶进行该SNP位点基因型的检测。

限制性内切酶选择结束，简单而高效~

二、 设计扩增引物

从序列的酶切位点分布看，这个酶有四个识别位点：

本着RFLP的引物设计原则，应该保证扩增产物中只有一个识别位点，因此可以在上述蓝色方框范围内使用Primer premiere进行引物设计，使产物长度为200~1000bp，且酶切位点左右序列长度差异＞100 bp以保证电泳带型明显。

引物设计好之后，将F/R引物的扩增产物新建一个SnapGene文件，准备进行PCR电泳预测：

点击“Tool”标签栏中的“模拟DNA电泳”，弹出新的页面，其中：

点击电泳图中的MW，选择需要用到的Marker：

点击泳道1，选择使用F和R引物扩增该条带：

点击泳道2，选择使用Hpy188I酶切扩增条带：

最后调整一下胶浓度和电泳时间，就得到了完美的模拟电泳条带图，以他为目标，放手去做吧！