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RNA-RNA pull-down是检测RNA与其靶RNA之间相互作用的主要实验手段之一。RNA-RNA pull-down使用体外转录法标记生物素RNA探针，然后与胞浆提取液孵育，形成RNA-RNA复合物。该复合物可与链亲和素标记的磁珠结合，从而与孵育液中的其他成分分离。复合物洗脱后，通过qRT-PCR实验检测特定的RNA是否与靶标RNA相互作用。

 

 RNA-RNA pull-down实验结果为RNA产物的测序或qPCR结果，下图为qPCR结果示例：

RNA-RNA pull-down q-pcr结果图.png.jpg

材料和试剂

  1. 10 cm 组织培养皿
  2. 1.5 ml 离心管
  3. PCR管
  4. 15 和 50 ml离心管
  5. qPCR板
  6. 细胞
  7. 3’BIOTIN 标记合成的miRNA 序列
  8. 磷酸盐缓冲盐水 (PBS)
  9. 蛋白酶抑制剂（100x）
  10. RNase 抑制剂
  11. 链霉亲和素-Dyna 珠（Dynabeads™ M-280 Streptavidin）（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：11205D )
  12. 酵母 tRNA（原液 10 mg/ml，作为杂交封堵剂，保护探针）
  13. TRIzol（Thermo Fisher Scientific，Ambion TM )
  14. 氯仿
  15. 异丙醇
  16. GlycoBlue TM共沉淀剂
  17. 200 proof纯酒精（Sigma-Aldrich，目录号：E7023）
  18. 无核酸酶水
  19. 逆转录系统（Promega，目录号：A3500）
  20. Micro RNA RT 试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Applied Biosystem TM）
  21. miRNeasy Mini Kit（QIAGEN，目录号： 217004 )
  22. Qiashredder（QIAGEN，目录号： 79656 )
  23. RNAiMax（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：13778150 )
  24. 氯化钾 (KCl)
  25. 氯化镁 (MgCl 2 )
  26. Tris-盐酸盐（pH 7.5）
  27. IGEPAL CA-630（Sigma-Aldrich，目录号：I8896）
  28. 氢氧化钠 (NaOH)
  29. 氯化钠 (NaCl)
  30. 裂解缓冲液（见配方）
  31. 溶液 A（见配方）
  32. 溶液 B（见配方）

设备

  1. 磁力架
  2. 迷你管旋转器
  3. 冷冻离心机
  4. ABI Step one plus Q-PCR 系统（
  5. 96孔PCR仪
  6. -20°C 冰箱
  7. 涡旋器

步骤

合成在 3′ 末端用生物素标记的目标 miRNA 和对照 miRNA。在转染前一天将细胞接种在 10 cm 组织培养皿中，一式两份。24h后，用对照 miRNA 和 3′ 生物素标记的 miRNA 转染细胞，最终浓度为 10-100 nM。根据转染试剂制造商的指南进行转染。转染后48h，收获全细胞裂解物。（时间和浓度需要优化，因为它随细胞系和 miRNA 变化）。转染后一天可以更换培养基。

  1. 细胞裂解液制备
    1. 从培养皿中吸出培养基，用冰冷的 1x PBS 仔细清洗细胞两次。刮去或胰蛋白酶消化细胞，在 4°C 下以 2,000 xg旋转5 min。收集沉淀前预冷微量离心管。
      注意：此时细胞沉淀可以储存在-80°C。
    2. 如果继续使用裂解液，则添加 550 μl 裂解缓冲液，并补充蛋白酶抑制剂 (PI) 和 RNase 抑制剂。（始终在裂解时添加 PI 和 RNase 抑制剂）。轻轻吹打将细胞与裂解缓冲液混合。在冰上孵育 10 min。将细胞裂解物在 4°C、14000rpm 下离心10 min。将上清液收集到新的微量离心管中。
    3. 同时，准备链霉亲和素-Dyna 珠（每个样品 50 μl）。
    4. 用 500 μl 溶液 A 清洗珠子两次。
    5. 用 500 μl 溶液 B 清洗珠子两次。
    6. 用 1 ml 裂解缓冲液清洗珠子 3 次。在每次洗涤时，将管子放在磁力架上，小心地取出上清液，不要取出珠子。
    7. 用 500 μl 裂解缓冲液和 10 μl 酵母 tRNA 在旋转器上在 4°C 下孵育珠子 2h。
  2. Pull down
    1. 孵育 2 h后，将装有珠子的管子放在磁力架上，取出上清液，用 1 ml 裂解缓冲液清洗珠子一次。
    2. 将 500 μl 裂解物与珠子混合，并在 4°C 下在旋转器上孵育过夜。在 -80 °C 保存超过 50 μl 裂解液，用作input。
    3. 第二天，将管短暂离心并将其放在磁力架上并去除上清液。用 1 ml 裂解缓冲液清洗珠子 4 次。
  3. RNA分离
    1. 从-80°C 取出保存的裂解物，在冰上解冻。
    2. 将 750 μl Trizol和 250 μl 水添加到每个样品的输入和下拉的磁珠中并混合均匀。将管子放在 -20°C 的冰箱中至少 2 h（管子可以保持在-20°C 过夜）。
    3. 在室温下解冻混合物，加入 200 μl 氯仿，涡旋 45 秒，并在室温下保持 2-3 min。
    4. 在 4 °C 下以 12000rpm 离心15 min。
      注意：提前打开离心机，以便在管子准备好旋转时它已经在 4°C。
    5. 将上层转移到新管中（大约为 500-600 μl）。丢弃旧管。
    6. 加入等体积的异丙醇和 5 μl 糖蓝，颠倒试管数次混合。在 RT 中孵育 10 min。
    7. 在 4 °C 下以12000rpm 离心15 min。非常小心地丢弃上清液。用 1 ml 预冷的 70% 乙醇洗涤沉淀两次。
    8. 洗涤时小心去除上清液。风干沉淀并将其重悬于 20 μl 无核酸酶水中。
  4. 逆转录聚合酶链反应
    1. 使用来自生物素标记样品的 20 μl RNA 和来自input样品的 1 μg RNA 用于 mRNA RT 反应。根据制造商的说明设置 mRNA RT 反应。
    2. 使用 TaqMan miRNA 逆转录试剂盒和input样品的特定 miRNA 引物，每 15 μl 反应，使用 10 ng 总 RNA。
    3. 使用 mRNA-RT Kit 制备的 cDNA 对目标 mRNA 进行三次重复的 q-PCR。cDNA 的体积需要优化，因为目标的结合能力会有所不同。如果可能，请包括阳性对照（特定 miRNA 的已知靶标）。GAPDH 可用作内参。
    4. 对于miRNA 水平，使用miRNA cDNA 一式三份运行单独的 q-PCR。U6 可用于上样控制。

数据分析

计算 miRNA 富集如下：
目的miRNA下拉样本中mRNA的Ct值/对照miRNA下拉样本中mRNA的Ct值= X
目的miRNAinput样本中mRNA的Ct值/对照miRNAinput样本中mRNA的Ct值 = Y
Fold binding = X/Y。
结果表示为三个独立实验的平均值±标准差，每组实验至少重复三次。来自多次测定的数据进行双尾t检验，P值 < 0.05 被认为具有统计学意义。

配方

  1. 裂解缓冲液
    20 mM Tris-HCl (pH 7.5)
    100 mM KCl
    5 mM MgCl 2
    0.3% IGEPAL CA-630
  2. 溶液 A
    0.1 M NaOH
    0.05 M NaCl
  3. 溶液 B
    0.1 M NaCl
    70% 乙醇
    用 200 标准 100% 乙醇中的无核酸酶水稀释并在使用前预冷

RNA pull-down操作手册

原文见下一页

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