肝素抗凝外周全血，过敏原刺激（如花生）或Anti-IgE (BD Bioscience, San Jose, CA)刺激（阳性对照）或PBS未刺激（阴性对照） 后，用anti-CD63-PE (Clone H5C6), anti-CD203c-PECY7 (Clone NP4D6), anti-CD45-AF700 (Clone 2D1), anti-IgE-FITC (Clone Ige21), anti-CD123-PerCPCy5.5 (Clone 6H6), 和 anti-CD193-APC (Clone 5E8) (Thermo Fisher, Waltham, MA) 4°C 染色 30 min。每个抗体滴度确定最佳染色浓度。BD FACS lysis solutions (BD Bioscience, San Jose, CA)裂红。采集至少500个嗜碱性粒细胞（CD123/CD193/IgE阳性细胞）（图1(a)）。嗜碱性粒细胞活化是通过测量CD63阳性嗜碱性粒细胞的百分比以及与阴性对照相比CD203c MFI的强度变化来确定的。

检测阈值定义：

• CD63阳性比例

• 在CD203c测定中，MFI折叠比

样品在2-37°C范围内保存或运输1天，结果稳定；对报告结果的建议是，半定量结果，剂量反应曲线的轨迹，CD63 / anti-IgE比率，CD63阳性细胞的百分比和CD203c MFI比率都应提供给临床医生，并附有实验室提供的建议解释。这种解释类似于病理学家关于手术标本组织学的报告。

选择正确的对照，包括用于测量背景激活的PBS对照和用于验证通过IgE / IgE受体通路的功能信号传导的反IgE对照对于结果的解释至关重要。大约10%的患者是IgE / IgE受体途径无应答者（Puan等人，2017）。因此，为了区分无应答样本和非活性样本，建议添加一个额外的管子，用fMLP（f-Met-Leu-Phen）刺激，一种IgE独立的嗜碱性粒细胞激活剂，作为额外的阳性对照（Ebo&Bridts，2009;  Knol等人，1990年）。