前言

提起“克隆”、“载体构建”这两个词，似乎总会同时提到“限制性内切酶”。没错，在过去数十年，用限制性内切酶产生黏性末端，并通过碱基互补配对，连接两个甚至更多片段的克隆方法，是载体构建的经典方案。

近年来，“无缝克隆”逐渐受到科学家的欢迎。相比之下，无缝克隆操作更加简单，灵活性更强，同时几乎不受序列的限制，一次可定向组装高达10个片段的dsDNA。这篇文章将带大家认识无缝克隆的原理、优势和应用。

一、无缝克隆的原理

首先要强调的是，无缝克隆有两个主要的流派：Gibson assembly和Golden Gate assembly。由于Golden Gate assembly依赖于Type IIS限制性DNA内切酶（如BsaI，BbsI等），一旦载体不携带相应的识别序列，这种方法就走不通了。而假设通过PCR引入Type IIS内切酶识别序列，那便不是真正意义上的“无缝”了。因此本文所提的“无缝克隆”，特指Gibson assembly流，不涉及任何Golden Gate及其他流派。

目前，无缝克隆比较著名的商品化名字有NEB家的Gibson Assembly和NEBuilder HiFi DNA Assembly，Clontech家的In-Fusion，以及Invitrogen家的GeneArt等。但无论叫什么名字，其基本原理都和早期的Gibson assembly的是一样的。

与传统的双酶切克隆一般，无缝克隆同样需要依赖于dsDNA的黏性末端进行互补配对，并利用DNA连接酶催化形成磷酸二酯键修复缺口（nick）。但是，无缝克隆并不使用“内切酶”来制造黏性末端，而是通过“外切酶”来产生的。

（Tips 1：“内切酶”是在核酸链内部进行“一刀两断”剪切的酶，而“外切酶”是在核酸链的末端、即外部进行“逐个碱基”剪切的酶）

在无缝克隆中使用的外切酶是T5核酸外切酶，它能沿着5’→3’方向，降解dsDNA，从而产生黏性末端。

（Tips 2：T5外切酶同时具有ssDNA外切酶活性，但并不降解超螺旋dsDNA。）

读到这里大家应该能想到，假设要拼接的两个片段的末端，是一模一样的碱基序列，那么通过T5外切酶，就能产生几乎一致的黏性末端了。没错，无缝克隆的原理便是如此。如下图所示，假如我们需要将3个片段按照1→2→3的顺序拼接起来，只需要保证1的末尾和2的开头，以及2的末尾和3的开头，具有同样的序列即可（我们可称之为同源臂）。这个同源臂序列，并不是额外添加进去的，而是载体或者拼接片段本身携带的。也就是说，我们可以通过PCR的方法，在外源拼接片段的两端加上线性化载体的序列即可。

但是，T5外切酶并不能保证将每一个片段的5’末端都降解成一样长的黏性末端，退火之后，极可能存在缺失的碱基。这时候，就需要借助DNA聚合酶，也就是我们平时用于PCR扩增的酶进行修复。最后一步，便是借助Taq DNA连接酶，催化形成磷酸二酯键，将所有缺口补齐。

有心的读者会发现，假设T5外切酶一直降解dsDNA的5’末端，岂不是最终会将其变成ssDNA？这样如何进行下游的拼接？难道仅仅依靠DNA聚合酶的5’→3’合成双链的反应与之竞争？

无缝克隆的另一高明之处，就是利用高温。T5外切酶的最适温度是37℃，然而无缝克隆是在50℃下进行的，加之添加的酶单位较少，因此整个反应体系很快便会失去外切的活性，而DNA聚合酶的活性得以维持。而为了保证DNA连接反应顺利进行，无缝克隆采用的是热稳定的Taq DNA连接酶，而非传统的T4 DNA连接酶。同时，为了保证黏性末端能够在50℃下进行互补配对，同源臂的长度一般>15 bp。

二、无缝克隆的优势

不受片段序列的限制、实现任意组装，是无缝克隆的最大优势。

传统的酶切克隆，需要克隆载体的多克隆位点携带可用的单一酶切位点。假如这些酶切位点在外源片段之中同时存在，克隆就会受到限制。而无缝克隆不依赖于限制性内切酶，仅靠同源臂进行互补配对。因此每次进行片段拼接时，仅需通过引物制作同源臂，而不需要像以往一般仔细地检查PCR出来的外源片段内部是否同时会被内切酶消化。与此同时，我们也不再需要购买各式各样的内切酶，只要一个试剂盒就可解决所有克隆实验。

无缝克隆第二个优点是可以同时无缝地拼接多个片段。传统的酶切克隆，由于酶切位点有限，我们能组装的片段数量是有限的。同时，由于酶切位点之间存在着一定的空间距离，片段与片段之间不可避免地会产生间隔，或者说“缝隙”。此外，酶切克隆通常一次只能拼接2-3个片段。随着拼接片段的增多，传统方案的效率会急剧降低，通常只能分多次拼接。

（Tips 3：过去有一种提高酶切连接多片段的方法，是在连接后，在载体和外源片段的边界上设计引物，进行一轮PCR，扩出全长连接产物，跑胶纯化后再进行二次连接。然而这种方法耗时耗力，且长片段的PCR容易突变或失败，同时PCR的引物还引入了更多的无意义序列。）

而无缝克隆可轻松拼接4-5个片段，最高可达10个，而且只需要将所有片段混在一个管子里，进行一步反应。

节省时间，是无缝克隆的第三个优势。传统的酶切克隆，首先需要进行PCR，胶回收，然后酶切载体和外源片段，再过柱纯化，随后连接，最后转化。而如果需要进行多片段组装，部分步骤还需重复几轮。每多一个片段，可能要多花费三天到一周的实验时间。而无缝克隆仅需PCR和胶回收，随后即可直接进行多片段拼接。拼接10个片段所花的时间，跟拼接2个片段的几乎是一样短的。

常见问题答疑：（视频转自碧云天的公众号）

三、应用举例

例一：无缝克隆在CRISPR中的应用。

CRISPR介导的基因敲除依赖于Cas9等内切酶，以及帮助内切酶定位到指定位点的gRNA。在一个细胞系中同时敲除多个基因，虽可以通过转染多个gRNA表达载体来实现，但这种方案存在随机性，并不能保证每个细胞都能获得所有的gRNA载体。而通过无缝克隆，我们可将多个U6启动子和gRNA序列（包括spacer和scaffold）元件串联起来，实现一个质粒表达多个gRNA。

（Tips 4：目前还有其他多种multiplex CRISPR的方案，各有优缺点。请自行查阅文献，本文不赘述。）

基因定点敲入（knock-in），需要在打靶区域DNA产生双链断裂，并以含有上下游两段同源臂外加插入基因序列的供体作为修复模板，实现外源序列的插入。简而言之，供体质粒需要含有5’同源臂 + 插入序列 + 3’同源臂，以及基本质粒骨架（含有ori、抗性基因等基本元件，方便生产供体质粒）共计4个部分构成（见下图）。通过无缝克隆，我们可以轻松地将这4部分片段通过一步反应拼接出来。

例二：用无缝克隆构建多顺反子表达载体。

将EGFRvIII基因、P2A多顺反子元件、iRFP720基因拼接到pLVX-TetOne载体中（如下图），实现Tet-on诱导表达EGFRvIII基因，同时还能表达iRFP720基因，用于小动物活体荧光成像。

（Tips 5：有关多顺反子元件的介绍，请阅读本专栏的另一篇文章 多顺反子表达元件——一次满足你N个愿望）

假如使用双酶切克隆，你会发现，只有AgeI和BstZ17I酶切位点可用于EGFRvIII基因克隆，因为另外两个酶切位点同时存在于该基因内部。而P2A元件和iRFP720基因必须和EGFRvIII基因处于同一个读码框，我们没有办法使用AgeI进行后续的克隆了。

本司机的做法是，直接用PCR构建出各个部件，然后通过无缝克隆一步组装。这几个部件分别是：

1、pLVX-TetOne载体的一半；

2、pLVX-TetOne载体的另一半；

3、EGFRvIII；

4、P2A + iRFP720。

将pLVX-TetOne通过PCR拆成两半的原因是：质粒超过8 kb，直接通过PCR线性化整个质粒的突变几率，比扩增两个4 kb的片段要略高一些。同时，由于两个4 kb片段在跑琼脂糖时，可以和8 kb的环状PCR模板区分开来，因此可以直接切胶回收，而不需预先进行DpnI去除环状质粒，即可实现零背景的转化。

（Tips 6：线性化质粒也可以通过单酶切或双酶切来实现。）

P2A元件非常短，仅有66 bp，很可能被T5外切酶彻底降解。不过，我们只需通过两轮PCR，在扩增iRFP720基因的上游引物的5’端引入部分P2A序列（每次引入33个碱基），即可获得P2A + iRFP部件。

（Tips 7：有关无缝克隆的引物设计，可直接使用所购试剂盒厂家的线上工具。我个人比较喜欢用NEBuilder HiFi DNA Assembly，传送门 NEBuilder Assembly Tool。使用之前，可以用Word等文本编辑软件，将所要拼接的序列按5’→3’依次排好，用不同颜色区分标注，然后再挨个粘贴到线上设计工具中即可。此外，该试剂盒似乎通过调整酶浓度和buffer的离子浓度，克服了T5外切酶对ssDNA的活性，从而可以用ssDNA oligo桥接任何dsDNA片段。具体内容请参考NEB公司的宣传页面。）

四、目前存在的问题

吹了半天，无缝克隆其实也不是完美的。细心的读者可能已经发现，前面提到，P2A太短无法直接拼接。是的，无缝克隆目前无法组装小片段，因其可能会被T5外切酶彻底降解。Addgene blog指出，用于Gibson assembly的片段最好不低于200 bp，而NEB官方的线上设计软件，强制输入片段的长度必须大于75 bp，并提示最好不低于110 bp。

（注：NEBuilder试剂盒号称可用短至60 nt的单链oligo桥接两个dsDNA，或者在桥接的同时在两者之间引入短片段，而其他试剂盒做不到，具体机制正如前文所提的T5外切酶对ssDNA的活性。但本人并未亲测是否真实可靠。）

其次，由于无缝克隆依然依赖于前后两条同源臂黏性末端的互补配对，假设黏性末端内部恰好形成了稳定的二级结构（如发夹结构），无缝克隆的效率便会显著降低。虽然这只是个概率的问题，但万一实验失败，在洗完脸后，不妨检查一下同源臂及临近序列会不会产生稳定的二级结构。（注意：反应温度是50℃，也不算低了，通常只有脸太脏的时候才会这么倒霉。）

最后，无缝克隆中所使用的连接酶，是有所谓的“保真性”的。DNA连接酶所实现的功能，是催化形成磷酸二酯键，将两个脱氧核苷酸连接起来。这同时也意味着，我们并不希望见到，含有错配互补序列的片段，也被连接起来。经典酶切克隆法使用的是保真度低、即对错配容忍度极高的T4 DNA连接酶。但由于酶切克隆所产生的黏性末端是完全一致的，因此基本不可能出现问题。而无缝克隆虽然借助了序列完全一致的同源臂，但T5外切酶并不能保证仅消化同源臂的部分。再加上在互补配对时，长链黏性末端极易随机产生不完美的配对，因此导致拼接错误。DNA连接酶的保真度，是由酶的类型，以及反应条件（温度、缓冲液pH、盐强度等）决定的。不同无缝克隆试剂盒的厂家，可能有不同的配方，至于哪个最适合你，就只能靠自己摸索了。而至于DNA聚合酶的保真性，由于需要合成的碱基数少，并非传统的PCR应用，因此一般不会在这个环节翻车。

附上进哥做的基于碧云天教程的分子量计算工具：

https://www.jingege.wang/bioinformatics/wfkl/%E6%97%A0%E7%BC%9D%E5%85%8B%E9%9A%86%E5%88%86%E5%AD%90%E9%87%8F%E8%AE%A1%E7%AE%97.html