蛋白质的糖基化（glycosylation）是目前已知最为复杂的蛋白质翻译后修饰，由8种单糖参与构成的各种复杂寡糖链与蛋白质连接形成。蛋白质糖基化分析包括：蛋白质是否发生了糖基化及糖基连接形式、糖基化位点分析和糖链结构分析。
蛋白质糖基化分析的方法主要有两种：内切糖苷酶分析N－连接寡糖和糖基化抑制剂。
蛋白质糖基化的基本原理是：寡糖中的N－乙酰葡糖胺与多肽链中天冬酰胺残基的酰胺氮连接，形成N－连接糖蛋白；寡糖中的N－乙酰半乳糖胺与多肽链的丝氨酸或苏氨酸残基的羟基相连则形成O－连接糖蛋白。糖蛋白可分布于细胞表面、细胞内分泌颗粒和细胞核内，也可被分泌到细胞外构成细胞外基质。真核细胞内大约50％的蛋白质属于糖蛋白（glycoprotein）蛋白质糖基化所形成的糖链一般含有1015个单糖基，理论上计算会产生大抵的异构体。
- 内切糖苷酶分析N－连接寡糖
简介
如果蛋白质分子中有糖链存在，在体外使用可去除蛋白质中的N－连接寡糖的内切糖苷酶（endoglycosidase）、糖胺酶（glycosamidase）或者可去除O－连接寡糖的O－糖苷酶O－glycosidase）处理样品，然后和未经处理的样品共同进行SDS－PAGE，不含糖链的蛋白质的电泳迁移率会高于糖基化蛋白。因此，对这些酶的敏感性可用于检测N－连接寡糖或O－连接寡糖的存在。
原理
内切糖苷酶分析N－连接寡糖的基本原理是：N－糖苷酶和肽N－糖苷酶（Glycopeptidase F，GPase F）可以将糖链从天然或变性蛋白质的肽链骨架上完整地切割下来，去除所有的N－连接寡糖链。切割作用发生在最靠近天冬酰胺的糖与氨基酸的连接处。
试剂：
1、蛋白质A－琼脂糖珠
2、0.1mol/L的2－ME/0.1％SDS
3、0.5mol/L Tris－HCl（pH8.6）
4、10％NP－40
5、200－250mU/ml PNGase F
6、0.5mol/L Tris－HCl
步骤
内切糖苷酶分析N－连接寡糖的基本过程可分为如下几步：
A、［35S］－甲硫氨酸示踪标记细胞，裂解细胞后，用特异性抗体沉淀拟检测糖基化的目标蛋白，用蛋白质A－琼脂糖珠收集抗原抗体复合物。
B、在微量离心管中，向结合着抗原抗体复合物的琼脂糖珠中加入20－30ul 0.1mol/L的2－ME/0.1％SDS，充分混匀，90°C 3～5min，冷却后于1000g离心1min，将含有变性蛋白质的上清移至洁净的微量离心管内。
C、取10ul变性蛋白质上清，依次加入3微升0.5mol/L Tris－HCl（pH8.6）、5ul H2O、2ul 10％NP－40、5ul 200－250mU/ml PNGaseF。每加1种试剂后要混匀。对照管内以5ul 0.5mol/L Tris－HCl代替酶。
PS:建议摸索浓度，我的经验使用终浓度≥500 U/ml的PNGase F，并延长温育时间至12-16小时以确保完全去糖基化。此外本步骤缓冲液根据说明书选择，可以50 mM磷酸钠缓冲液（pH 7.5）或HEPES缓冲液（pH 7.0-8.0）等.
D、37℃温育过夜。
E、加入2.5ul10X SDS样品缓冲液，90℃5min，使PNGaseF失活。
F、SDS－PAGE分离蛋白质，进行western blot。电泳迁移率的增加表明存在N－连接寡糖链。
注意事项
可以用pH7.0的磷酸钠或HEPES缓冲液代替Tris－HCl，不能使用含钾盐的缓冲液，因其引起SDS沉淀。
2. 糖基化抑制剂用于鉴定糖蛋白
原理
衣霉素是一种N-糖基化抑制剂，它通过阻断N-乙酰葡萄糖胺-1-磷酸转移酶（GPT）的活性，从而抑制N-连接糖基化的第一步，也就是将糖链转移到新生多肽的Asn-X-Ser/Thr序列上。因此，当细胞被衣霉素处理后，目标蛋白的糖基化会被抑制，导致其分子量减少，这在WB结果中应该会显示为条带位置的下移。。
细胞处理与分组
A.细胞培养
选择目标蛋白表达的细胞系（如HEK293、HeLa等），常规培养至对数生长期。
B.衣霉素处理
实验组：添加衣霉素（终浓度1-5 μg/mL，需预实验优化），处理12-48小时。
对照组：等体积DMSO（溶剂对照）处理相同时间。
可选阳性对照：取部分细胞裂解液，用PNGase F（去N-糖基化酶）37℃处理1小时。
C.蛋白样品制备
裂解细胞：RIPA裂解液（含蛋白酶抑制剂）冰上裂解30分钟，离心取上清。
定量：BCA法测定蛋白浓度，调整至等量。
变性：加入5×SDS上样缓冲液，95℃煮沸5分钟。
D.Western Blot检测
