工具/原料dNTPs 、10×Buffer 、Taq 酶为Promega公司。
方法/步骤1:
1.引物设计:需要将A片段的3’端引物含有B片段的一部分,B片段的5’端引物含有A片段的一部分,这样分别扩增获得A和B就含有了互补片段。
如图中第一步中的P2含有一部分B片段序列,P3含有A片段一部分序列
方法/步骤2:
2.分别PCR扩增A和B片段,25μL体系一次扩增8管含有一管阴性对照,切胶回收这两个片段。
如上图第一步,单独扩增A和B片段
方法/步骤3:
3.以A和B两个片段为模板,进行融合PCR实验。融合PCR分为两步,操作步骤如下:
第一步:(不加引物)
dNTPs 1μl
10×Buffer 2.5μl
Template DNA (A和B) 各1μl
Taq 酶 0.5μl
RNaseA-free H2O 19μl
Total 25μl
循环参数:95℃预变性 5min,94℃变性 20s、57℃退火 20s、72℃延伸 40s 进行 10个循环,72℃延伸 5min。
如上图第二步:(第一步不需要添加引物,因为让A和B片段具有互补片段,可以互为引物扩增)
方法/步骤4: