我们先进行一个简单的计算，常规的RT-qPCR 1个反应（1个复孔）需要的total RNA至少0.1-1ug左右。我们按照最小反应起始量来算的话，那么1个反应需要至少100ng的total RNA，3个技术重复（3个复孔），总计total RNA为300ng。

我们知道total RNA中绝大部分为rRNA，那么只有不到5%的RNA为我们需要研究的对象。PCR反应需要引物跟目标序列区域进行充分碰撞，那么如果只使用mRNA会大大降低一次PCR反应的起始量。通过计算我们认为5-10ng做1次PCR反应较为合理。也就是1个样本中验证1个基因不做生物学重复只做3个复孔需要至少15ng的mRNA或300ng的total RNA。那么3个生物学重复就需要9个反应，总计45-90ng mRNA或900ng的total RNA。

根据上面的推算，IP下来的RNA若有500ng，可以验证6-12个基因左右（1个基因3个生物学重复，每个重复3个复孔即技术重复，所以一个基因总计9次反应）。哺乳动物IP效率在10-20%左右，植物在20-40%左右（最高可达50%）。那么假设要验证6-10个基因，哺乳动物需要至少2.5-5ug的mRNA和100-200ug的total RNA，植物样本至少需要1.25-2.5ug的mRNA和50-100ug的total RNA。若加入IgG抗体这个步骤，则需要对total RNA的起始量再次翻倍。

那么接下来在进行讲解前的第二个问题就是，明明我们做高通量测序只有一个input文库和一个IP文库，为何我们做m6A-IP–qPCR 要加入IgG抗体呢（如下图所示）？

那是因为高通量测序可以对所有被m6A抗体富集下来的RNA进行全转录层面的扫描分析，一旦m6A抗体有非特异性富集，在数据呈现上我们可以明显发现reads的分布比较乱且没有规律，而特异性富集则reads几乎富集在哺乳动物的3’ UTR区和植物的5’ UTR和3’ UTR区。所以这就是测序不需要IgG文库，而我们做m6A-IP–qPCR 需要IgG富集的原因。

搞定了样本起始量和IgG的问题后，我们具体来看下步骤：

第一步，先对RNA进行特异性富集和打断。即在打断之前，我们需要搞清楚研究对象只是mRNA还是lncRNA。若只研究mRNA 可以先用oligodT磁珠进行富集后再进行打断。如果是lncRNA和mRNA都要研究，则需要先用试剂盒将total RNA的rRNA先去除干净，再进行打断。如果是进行高通量测序打断长度约为100nt左右，而qPCR 则需要长度至少在200nt以上，部分论文甚至打断长度在300-500nt左右。一般根据文献中的资料显示，IP下来的片段用引物扩增出来的长度在130-150左右，所以100nt不到的长度要设计出合适的引物会非常困难。除非是用5’RACE扩增，否则还是建议大于200nt。

第二步，对打断完了的RNA片段进行抗体孵育和特异性富集。打断完了RNA我们会得到长度约为200-300的RNA片段。这时候我们可以分出约占m6A-IP部分RNA只有10%的RNA作为input。简单来说用于m6A IP的RNA有2ug，那么input的RNA需要在200ng左右。IgG富集的RNA起始量与m6A-IP的量一样，比例为1:1即2ug。

第三步，洗脱和逆转录扩增。接下来我们需要对m6A抗体和IgG抗体上洗脱下来的RNA，以及input的RNA，按照常规试剂盒要求进行洗脱，并用随机引物进行逆转录。

第四步，设计m6A-IP–qPCR 的特异性引物。由于m6A甲基化基本富集在UTR区和转录终止区，所以如上图所示在这些区域附近我们可以从测序结果里有明显的peak峰。那么我们设计引物可以考虑在基因高甲基化区域来进行。如果某几个常见的基因在不同文献里频繁出现，那么文献里列出来的引物可以被我们直接拿来引用。通常最后PCR产物长度会在130-150bp左右。这里需要注意的是，IP下来的RNA需要用随机引物进行逆转录，而第四步中设计的引物用的是特异性引物，这个大家要注意区分和甄别。

第五步，使用上一步设计好的引物，对input、m6A-IP和IgG-IP中的RNA进行qPCR反应并计算相应的CT值。

MeRIP-qPCR 是m6A-IP-qPCR 的另一种说法。所以从名称上我们就能发现，m6A-IP–qPCR基本和常规的RIP–qPCR相似。当然在讨论RIP–qPCR之前，我们先来看看常规的RT-qPCR 是如何计算相对表达量的。

关于RT-qPCR的方法学论文很多，所以这里关于实验部分就不细讲了。计算基因的绝对定量需要加入外参基因，所以暂且我们先来看看相对表达量，也就是RT-qPCR传统的2^-△△Ct法是如何计算的。

假设验证一个基因，那么3个生物学重复（biological replication）是必须的，每个生物学重复要做3个复孔，我们也称之为技术重复（technical replication）。那么一个基因总共要做9个反应。

每1个样本的1个基因做3个复孔，内参基因和目的基因的Ct值分别取均值，最后得到Ct内参和Ct目的。如哺乳动物会选择GAPDH作为内参基因。其公式为：

ΔCt=Ct_目的-Ct_内参

处理组和对照组的所有样本都要这样计算。例如，处理组和对照组分别有3个和3个样本（即3个生物学重复），你会分别得到处理组的3个ΔCt和对照组的3个ΔCt。

然后用t检验检验下3个处理组样本的ΔCt和3个对照组样本ΔCt之间是否有统计学差异。将处理组的3个ΔCt取均值得到ΔCt_处理组，将对照组的3个ΔCt取均值得到ΔCt_对照组。最后来计算ΔΔCt和相对表达量（即2的–ΔΔCt次方），公式分别为：

ΔΔCt=ΔCt_处理组-ΔCt_对照组

相对表达量=2^{（-ΔΔCt）}

也就是处理组中某基因的表达量是对照组中表达量的2^-ΔΔCt倍。我们假设ΔCt_处理组和ΔCt_对照组分别是7和10，那么ΔΔCt=-3，最后相对表达量为8（2的3次方）。

我们从传统的RT-qPCR会发现，每个样本都要做一个内参基因，如上面提到的哺乳动物会选择GAPDH，而miRNA则会选择U6。那么我们的m6A-IP–qPCR 是不是也需要内参基因，根据我们查阅的大量文献来看，绝大部分是没有的，少量文献也会使用到内参基因或者我们称之为negative control gene。

那么是不是m6A-IP–qPCR 就真的没内参了呢？其实也不是！实际上我们会发现整个input充当了内参基因的概念，一个基因的甲基化水平是无法直接用RIP下来的RNA在做qPCR后直接用Ct值高低来衡量的，需要input中的RNA作为背景。而IgG抗体的加入则是为了排除m6A抗体非特异性结合情况发生。由于有时候m6A抗体不同厂家、保质期、蛋白性能等因素可能会产生非特异性结合的结果，这时候就需要用IgG来排除这部分的干扰。目前市面上使用的绝大部分m6A抗体为兔抗，那么尽量在使用IgG做对照时也使用兔抗来源的IgG。

那么我们首先依旧是与传统的RT-qPCR相似，用相应的软件实时监测扩增曲线。溶解曲线必须是单峰，以保证引物特异性扩增。然后就是校准每一个样本的平均Ct值，以消除样本准备过程中的差异。

接下来我们就要开始对每个样本中，RIP和input的3个技术重复得到的Ct值计算平均值，再对3个生物学重复样本中的Ct平均值再去计算其Ct平均值，得到Average Ct _RIP和Average Ct _input。最后计算稀释系数，即input dilution factor，也就是input的RNA占m6A-IP的RNA有多少比例。根据上面的示例，也就是input RNA=100ng而m6A-IP RNA=1ug，那此处的稀释系数=10%。最后根据这些数值，我们可以计算出归一化后的ΔCt值，也叫ΔCt _{normalized RIP}。

这里为什么归一化后的ΔCt _{normalized RIP}还要减去log₂^{（input dilution factor）}呢？那是因为需要减去input的噪音，排除其干扰。由于RNA样本特别稀少，所以在做实验的时候往往会把input的使用量按照一定比例减少。如本文中input的占比就只有10%，那么稀释倍数（Input Dilution Factor）就是0.1。最极端的情况，就是RNA十分的富余，所以当input的比例理论上和m6A-IP及IgG-IP的比例一样时，那么log₂^{（input dilution factor）}=0，也就无需相减了。所以加入稀释系数的校正，目的就是为了达到input：m6A-IP：IgG-IP=1：1：1的效果。

下一步就是要计算在RIP下来的RNA中某一个基因占input中这个基因有多少的百分比。换句话说就是有input中的某个基因究竟有百分之多少发生了甲基化，所以这里我们用%input来表示。基本上到这一步，部分老师不想做IgG验证的，会把这个数据直接放在论文里，但是我们建议还是要加入IgG的部分。当然这一步需要进行线性归一化处理，方法与上面的RT-qPCR 类似，其公式为：

%_input = 2^{（-ΔCt normalized RIP）}

由于无法判断m6A抗体是否存在非特异性富集的情况，所以要过滤这些噪音还需要使用兔抗IgG再对RNA进行一次富集。这时候就需要对ΔCt再次进行背景去除。其中需要检测的目的基因在IgG中的ΔCt值就是ΔCt _{negative control}。其公式为：

最后一步就是最激动人心的一刻，那就是计算甲基化富集倍数，也叫Fold Enrichment，其公式为：

那么不加IgG可以直接将结果用于论文中的数据呈现吗？其实在部分的高分文章中我们也发现不用IgG直接进行验证的，即用%input数据直接用于表示甲基化比例。但是为了保险起见，我们还是强烈推荐老师加入IgG组的数据用于后期校正。