在做完m6A测序后,如何对差异甲基化的基因进行验证。简单来说就是IP后如何进行qPCR 实验。我们遇到的第一个疑问就是究竟能用多少RNA来做后期验证呢?换句话说,假如要验证10个基因,究竟需要多少total RNA或polyA的RNA才合适呢?


所以到这里我们的实验部分已经完成了,简单总结下就是想要做够10个左右基因的验证,必须至少提供>200ug的total RNA以上。富集的RNA类型根据自己要求出发,如polyA RNA或rRNA-depleted RNA等,最后就是打断成200-300nt左右的长度。用于qPCR的RNA一共分成3类,即input、m6A-IP和IgG-IP,其中input占m6A-IP起始量约10%。如果用数字来表示那就是input需要100ng,m6A在IP前需要1ug,IgG在IP前也需要1ug。

所以接下来我们就要详细讨论下m6A-IP-qPCR 是如何计算相对表达量的。

你Get到了m6A-IP-qPCR正确的打开方式了吗?
本文方法参考来自以下几篇文献,若要了解详细的方法,老师可以自行下载对应文献查看。
m6A抗体富集这部分的protocol,请参考m6A权威,m6A-seq的发明人以色列特拉维夫大学医学院的Gideon Rechavi教授发表在Nature Protocols(Pubmed id:23288318)的文章。这里面会有非常详细的步骤教你如何做m6A抗体去IP带有甲基化修饰的RNA。到时候注意打断长度为200-300nt即可,打断需要做几次条件实验。也就是说除了打断长度转换成200-300nt,富集到的RNA从上机测序变为PCR外,其他所有步骤全部一样。文章中的生物信息部分可以忽略不计。
参考文献:
1. Weng, HY., et al. METTL14 Inhibits Hematopoietic Stem/Progenitor Differentiation and Promotes Leukemogenesis via mRNA m6A Modification. Cell Stem Cell 22.2 (2017).
2. Ma, CH., et al. RNA m6A methylation participates in regulation of postnatal development of the mouse cerebellum. Genome Biology 19.1 (2018): 68.
3. Liu, J., et al. m6A mRNA methylation regulates AKT activity to promote the proliferation and tumorigenicity of endometrial cancer. Nature Cell Biology 20 (2018): 1074
4. Weng, YL., et al. “Epitranscriptomic m6A Regulation of Axon Regeneration in the Adult Mammalian Nervous System. Neuron 97.2 (2018): 313.
5. Gagliardi, M., et al. RIP: RNA Immunoprecipitation. Methods in Molecular Biology 1480 (2016): 73.
6. Dominissini, D, et al. Transcriptome-wide mapping of N(6)-methyladenosine by m(6)A-seq based on immunocapturing and massively parallel sequencing. Nature Protocols 8.1 (2013): 176-189.
写得很详尽,非常受用!想请问一下,要是IgG组测不到Ct值,如何校正呢?
这个我也不清楚,按道理IgG组多少会有少量富集的,是足够PCR反应的,是不是您的样本量太少?如果qPCR扩增曲线可以看出有扩增,只是还未到达阈值,可以试试增加循环。