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绝对定量

绝对定量是用已知的标准曲线推算出某个样品中目的基因的拷贝数和浓度。

此方法所用目的基因标准品的浓度是已知的,该标准品中目的基因的量可以被精确测定,因此可将标准品稀释成不同浓度的样品,并作为模板来进行Real-time qPCR反应,以标准品中目的基因拷贝数的对数作为横坐标,以Ct值作为纵坐标,可绘制出一条标准曲线

对未知样品进行定量时,根据未知样品的Ct值,即可从标准曲线方程中推算出样品中目的基因的拷贝数。

标准曲线

含有目的基因片段的重组质粒作为标准品,对标准品进行连续的10倍梯度稀释,得到一系列浓度相差十倍的样品,以此为模板进行Real time qPCR扩增,由每个样品的Ct值相对目的基因的拷贝数的对数绘制标准曲线。

合格的标准曲线的要求[1]:

  • 标准曲线至少含有5以上的点;
  • 标准曲线的扩增效率均在95%~105%之间;
  • 相对系数R2值大于0.99;
  • 融解曲线均为单一的峰。

目的基因标准品构建流程

含目的基因的标准品的构建过程即目的基因PCR产物克隆过程,大体步骤如下:

  1. 使用与Real-time qPCR相同的引物对目标基因片段进行PCR扩增;
  2. 切胶回收对扩增产物进行纯化;
  3. 使用合适的质粒载体对PCR产物进行克隆;
  4. 选择克隆成功的菌落通过PCR检测是否携带目的基因;
  5. 将检测成功的菌落加使用液体培养基进行扩大培养;
  6. 对培养后的菌体进行质粒提取,部分质粒测序验证其插入片段的序列是否与目的基因一致;
  7. 验证后的质粒应用核酸蛋白微量定量仪测定其浓度和纯度,保存于-20℃。

目的基因克隆与质粒提取和浓度测定的详细过程见:PCR产物克隆基本过程质粒提取微量分光光度法测定核酸浓度

标准品中目的基因拷贝数计算

根据下面的公式计算标准质粒中目的基因的浓度[2]:

注1:DNA amount代表质粒的浓度,核酸蛋白微量定量仪测定的DNA浓度的单位一般为ng/μL,将其转换为g/μL得到的结果即为每μL标准质粒中目的基因的拷贝数。

注2:DNA length为质粒载体本身的长度与目的基因PCR产物长度之和。

[1] Zhang, X. X., Zhang, T., Zhang, M., et al., Characterization and
quantification of class 1 integrons and associated gene cassettes in
sewage treatment plants. Applied Microbiology and Biotechnology, 2009,
82(6): 1169-1177.

[2] Laing, D. W., Zhang, T., Fang, H. H. P., Real-time quantification of
dominant anaerobes in an upflow reactor by polymerase chain reaction
using a TaqMan probe. Water Science and Technology, 2008, 57(11):
1851-1855.

0 Replies to “荧光定量PCR-绝对定量”

  1. 请问绘制了标准曲线,但是是跑出了10的7-10的11次方copies/微升的标曲,但是我的试剂样品,ct值带入标准曲线后,是不在标曲范围内的,请问这个结果可信嘛?

  2. 请问大佬,我的研究用的绝对定量pcr,审稿人认为绝对定量最后的数值偏小,没有相对定量那么直观,想让补实验,但是我做实验几乎没有剩余的原始样本,剩余的RNA这么久应该也已经降解了,这种情况还能怎么办?或者怎样向审稿人解释呢?

  3. 您好,我想请问,检测不同组织中RNA病毒拷贝数时,已构建标准品质粒,当未知样品cDNA进行Real-time qPCR反应时,只需要确定未知样品中cDNA浓度一致再进行Real-time qPCR反应,还是也需要内参基因从而除去量多量少产生的反应差异?

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