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MSP原理:甲基化特异性PCR(MSP)其原理为:双链DNA变性解链后,在HSO3-作用下发生C→U转化,C若已有甲基化则无此改变;甲基化修饰只发生于5′→3′方向C-G相联结构的C上,因此在HSO3-作用后,DNA CpG岛若无甲基化,则序列中的改变为C→U,CG→UG,若有甲基化C不变,CG→CG,用不同的引物做PCR,即可检测出这种差异,从而确定基因有无CpG岛甲基化。从理论上说,DNA发生甲基化的MSP产物的序列与原序列比较,变化为C→T,CG→CG,相应其互补链的改变为G→A,CG→CG。然后根据目的基因修饰前后的改变,相应设计M和U引物,有时我们需要设计两轮引物!

图片来源:DNA甲基化和去甲基化| Abcam中文官网

上游3000 UCSC

DNA甲基化是哺乳类动物一个重要的基因外遗传信号.有研究表明,DNA甲基化与大多数肿瘤的发生相关,抑癌基因启动子CpG岛的高甲基化可引起抑癌基因表达沉默,细胞出现无节制生长,导致肿瘤的发生[1].目前,甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR, MS-PCR)是研究DNA甲基化最为常用且准确度较高的方法之一,而理想的引物设计则是其成功的关键因素之一.国外互联网上有1个提供免费在线引物设计程序“MethPrimer”,它能够预测CpG岛,根据实验者要求设计硫化测序PCR(bisulfate-sequencing PCR, BSP)和甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR,MSP)引物.本研究旨在介绍甲基化特异性PCR引物设计的原则及“MethPrimer”设计程序的使用方法和有关注意事项.

1、材料与方法

1. 1 序列的转换

    DNA经亚硫酸氢盐硫化处理后,DNA双链中的“C”转化为“U”,通过随后的PCR,将“U”转化为“T”,但亚硫酸氢盐不能使已发生了甲基化的DNA的“C”发生上述转化,因此,根据经亚硫酸氢盐处理的DNA模板设计引物时,先输入感兴趣的DNA序列,程序将会显示2种序列:一种是输入的源DNA序列;另一种是硫化处理后的DNA序列,除了CpG岛上的5甲基胞嘧啶(5mC)之外,所有非甲基化的“C”都转换成了“T”,根据转化后的序列设计引物,进行BSP和MSP.

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1. 2 CpG岛的预测[2]

    哺乳类动物基因组中5% ~10%是CpG(二核苷酸),其中70% ~80%呈甲基化状态,称为甲基化的CpG(mCpG).CpG的聚集称CpG岛,已知在所有管家基因和一些组织特异基因的5′端调控区均有CpG岛呈高度甲基化,基因组中平均100个bp有1个跨度为0. 5~5 kb的CpG岛.

    “MethPrimer”设计程序默认的CpG岛跨度至少为200 bp,GC含量>50%,CpG出现频率>0. 6.因此,符合这些参数的区域都默认为CpG岛,我们根据任意1个CpG岛设计引物进行扩增.

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1. 3 BSP的引物设计原则

    标准的PCR引物设计原则同样适用于硫化测序PCR(bisulfite sequencing PCR,BSP),除了标准PCR的一些参数外,“MethPrimer”应用3′端算法计算自身退火温度、末端退火温度、碱基对互补率、GC含量、解链温度(Tm),而且还提供了上游引物和下游引物的Tm区别,以及引物中最大允许的单核苷酸重复率.因为所有非甲基化的“C”都被转换成“T”,所以“MethPrimer”中默认的重复“T”为8个,而其他碱基重复数为5个.

    DNA的完全硫化是很重要的,因此应选择含尽可能多的非甲基化CpG的“C”区域作为源序列,设计引物.对于BSP,引物设计的原则[1]:①为了区别甲基化DNA和非甲基化DNA,引物不应含有CpG位点;②引物扩增的产物应包含尽可能多的CpG位点.

1. 4 MSP的引物设计原则[3,4]

    对于MSP需要设计2对引物,一对是针对于经亚硫酸氢盐处理的甲基化的DNA;另一对是针对于经亚硫酸氢盐处理的非甲基化的DNA.根据甲基化的DNA为模板的PCR扩增甲基化的DNA;根据非甲基化的DNA为模板的PCR扩增非甲基化的DNA.MSP引物设计的原则:①为了最大限度的区分甲基化与非甲基化,引物的3′端至少包含1个CpG位点,我们可以自己设定CpG的“C”距3′末端的最远距离.“MethPrimer”中默认值为3,即是在引物的最后3个碱基中,至少有1个是CpG的“C”.②引物序列中应包含尽可能多的CpG位点.③甲基化引物和非甲基化引物序列3′端应处于相同的CpG位点.如果,2对引物不在相同的CpG位点退火, PCR结果就不能准确反映样本DNA甲基化的情况.但是甲基化引物和非甲基化引物可跨越不同的长度,在起始位点和长度上也可以不同.一般非甲基化引物比甲基化引物长,因为受Tm值限制,由于非甲基化引物中的“C”转化成“T”,导致GC含量降低,从而引起Tm降低.④2套引物应有相近的Tm值,“MethPrimer”中默认2套引物Tm值相差不超过5℃,这种限制可使2个PCR反应在同一PCR仪中进行.

引物的成功设计对于PCR是至关重要的,硫化反应促使DNA链中的“C”转化为“U”,导致GC含量降低,使PCR反应后在序列中出现长的连续“T”,容易引起DNA链的断裂[5, 6].此外,纯化过程中的DNA的丢失,也是要考虑的另一个因素,这些因素又会影响下面的PCR的进行,这些都是设计PCR引物时需要考虑的.

    一般情况下, PCR产物的长度大于300 bp时,就很难以硫化DNA为模板进行扩增.因此,“MethPrimer”程序设计PCR产物的长度在100~300 bp, 200 bp的长度比较合适.与标准PCR不同的是甲基化PCR引物的长度,甲基化PCR一般需要更长的引物,引物长度在30 bp左右,原因是硫化降低了模板DNA的GC含量,使序列中出现长的连续“T”,导致很难选择具有合适的Tm值及稳定的引物;另一方面,为了区别硫化处理和没有硫化处理以及未完全处理的DNA,需要引物有足够数量的“C”,这些都增加了选择稳定引物的困难.因此,为了获得更稳定的双链,选择更长的引物是有必要的,因为DNA的Tm值取决于引物的长度[7].一般情况下,甲基化PCR引物的长度在20~30 bp.“MethPrimer”默认的引物长度在20~30 bp, 25 bp为最适长度.

    “MethPrimer”在设计引物时,不考虑输入序列中的重复元件和载体序列.因为,对于DNA甲基化的研究,我们一般注重有特点的序列或者序列中确定的区域,大部分这些序列或区域是启动子序列,因此载体序列不考虑;另一方面,输入的序列由程序模拟硫化处理发生了转化,这样重复的元件不再重复了,即使是引物位置所在的序列在转化前是重复序列,也不会影响引物的质量.

    总之,“MethPrimer”是一个特异性的针对硫化PCRs(BSP和MSP)设计引物的程序,其操作简便、快速、准确,对于研究DNA甲基化是一个至关重要的工具.目前,“MethPrimer”正在进一步地发展和完善,使它可以设计出更多其他的硫化PCRs的引物.

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