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酶不同,所需要的酶切位点的保护碱基的数量也不同。一般情况下,在酶切位点以外多出3个碱基即可满足几乎所有限制酶的酶切要求。在资料上查不到的,我们一般都随便加3个碱基做保护。

寡核苷酸近末端位点的酶切

(Cleavage Close tothe End of DNA Fragments (oligonucleotides)

为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求,NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助(比如在多接头上切割位点很接近时),或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。在本表中没有列出的酶,则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基,以确保酶切反应的进行。

实验方法:用γ-[32P]ATPT4多聚核苷酸激酶的作用下标记0.1A260单位的寡核苷酸。取1 µg已标记了的寡核苷酸与20单位的内切酶,在20°C条件下分别反应2小时和20小时。反应缓冲液含70 mMTris-HCl (pH 7.6), 10 mMMgCl2 , 5 mM DTT及适量的NaClKCl(视酶的具体要求而定)。20%PAGE7 M尿素)凝胶电泳分析,经放射自显影确定酶切百分率。

本实验采用自连接的寡核苷酸作为对照。若底物有较长的回文结构,切割效率则可能因为出现发夹结构而降低。

寡核苷酸序列

链长

切割率%

2 hr

20 hr

Acc  I

GGTCGACC

CGGTCGACCG

CCGGTCGACCGG

8

10

12

0

0

0

0

0

0

Afl  III

CACATGTG

CCACATGTGG

CCCACATGTGGG

8

10

12

0

90

>90

0

90

>90

Asc  I

GGCGCGCC

AGGCGCGCCT

TTGGCGCGCCAA

8

10

12

>90

>90

>90

>90

>90

>90

Ava  I

CCCCGGGG

CCCCCGGGGG

TCCCCCGGGGGA

8

10

12

50

90

>90

>90

>90

>90

BamH  I

CGGATCCG

CGGGATCCCG

CGCGGATCCGCG

8

10

12

10

90

>90

25

90

>90

Bgl  II

CAGATCTG

GAAGATCTTC

GGAAGATCTTCC

8

10

12

0

75

25

0

90

>90

BssH  II

GGCGCGCC

AGGCGCGCCT

TTGGCGCGCCAA

8

10

12

0

0

50

0

0

>90

BstE  II

GGGT(A/T)ACCC

9

0

10

BstX  I

AACTGCAGAACCAATGCATTGG

AAAACTGCAGCCAATGCATTGGAA

CTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT

22

24

27

0

25

25

0

50

>90

Cla  I

CATCGATG

GATCGATC

CCATCGATGG

CCCATCGATGGG

8

8

10

12

0

0

90

50

0

0

90

50

EcoR  I

GGAATTCC

CGGAATTCCG

CCGGAATTCCGG

8

10

12

>90

>90

>90

>90

>90

>90

Hae  III

GGGGCCCC

AGCGGCCGCT

TTGCGGCCGCAA

8

10

12

>90

>90

>90

>90

>90

>90

Hind  III

CAAGCTTG

CCAAGCTTGG

CCCAAGCTTGGG

8

10

12

0

0

10

0

0

75

Kpn  I

GGGTACCC

GGGGTACCCC

CGGGGTACCCCG

8

10

12

0

>90

>90

0

>90

>90

Mlu  I

GACGCGTC

CGACGCGTCG

8

10

0

25

0

50

Nco  I

CCCATGGG

CATGCCATGGCATG

8

14

0

50

0

75

Nde  I

CCATATGG

CCCATATGGG

CGCCATATGGCG

GGGTTTCATATGAAACCC

GGAATTCCATATGGAATTCC

GGGAATTCCATATGGAATTCCC

8

10

12

18

20

22

0

0

0

0

75

75

0

0

0

0

>90

>90

Nhe  I

GGCTAGCC

CGGCTAGCCG

CTAGCTAGCTAG

8

10

12

0

10

10

0

25

50

Not  I

TTGCGGCCGCAA

ATTTGCGGCCGCTTTA

AAATATGCGGCCGCTATAAA

ATAAGAATGCGGCCGCTAAACTAT

AAGGAAAAAAGCGGCCGCAAAAGGAAAA

12

16

20

24

28

0

10

10

25

25

0

10

10

90

>90

Nsi  I

TGCATGCATGCA
CCAATGCATTGGTTCTGCAGTT

12
22

10
>90

>90
>90

Pac  I

TTAATTAA

GTTAATTAAC

CCTTAATTAAGG

8

10

12

0

0

0

0

25

>90

Pme  I

GTTTAAAC

GGTTTAAACC

GGGTTTAAACCC

AGCTTTGTTTAAACGGCGCGCCGG

8

10

12

24

0

0

0

75

0

25

50

>90

Pst  I

GCTGCAGC

TGCACTGCAGTGCA

AACTGCAGAACCAATGCATTGG

AAAACTGCAGCCAATGCATTGGAA

CTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT

8

14

22

24

26

0

10

>90

>90

0

0

10

>90

>90

0

Pvu  I

CCGATCGG

ATCGATCGAT

TCGCGATCGCGA

8

10

12

0

10

0

0

25

10

Sac  I

CGAGCTCG

8

10

10

Sac  II

GCCGCGGC

TCCCCGCGGGGA

8

12

0

50

0

>90

Sal  I

GTCGACGTCAAAAGGCCATAGCGGCCGC

GCGTCGACGTCTTGGCCATAGCGGCCGCGG

ACGCGTCGACGTCGGCCATAGCGGCCGCGGAA

28

30

32

0

10

10

0

50

75

Sca  I

GAGTACTC

AAAAGTACTTTT

8

12

10

75

25

75

Sma  I

CCCGGG

CCCCGGGG

CCCCCGGGGG

TCCCCCGGGGGA

6

8

10

12

0

0

10

>90

10

10

50

>90

Spe  I

GACTAGTC

GGACTAGTCC

CGGACTAGTCCG

CTAGACTAGTCTAG

8

10

12

14

10

10

0

0

>90

>90

50

50

Sph  I

GGCATGCC

CATGCATGCATG

ACATGCATGCATGT

8

12

14

0

0

10

0

25

50

Stu  I

AAGGCCTT

GAAGGCCTTC

AAAAGGCCTTTT

8

10

12

>90

>90

>90

>90

>90

>90

Xba  I

CTCTAGAG

GCTCTAGAGC

TGCTCTAGAGCA

CTAGTCTAGACTAG

8

10

12

14

0

>90

75

75

0

>90

>90

>90

Xho  I

CCTCGAGG

CCCTCGAGGG

CCGCTCGAGCGG

8

10

12

0

10

10

0

25

75

Xma  I

CCCCGGGG

CCCCCGGGGG

CCCCCCGGGGGG

TCCCCCCGGGGGGA

8

10

12

14

0

25

50

>90

0

75

>90

>90

 

2.双酶切的问题

参看目录,选择共同的buffer。其实,双酶切选哪种buffer是实验的结果,takara公司从1979年开始生产限制酶以来,做了大量的基础实验,也积累了很多经验,目录中所推荐的双酶切buffer完全是依据具体实验结果得到的。

有共同buffer的,通常按照常规的酶切体系,在37进行同步酶切。但BamHI37下有时表现出star活性,常用30单切。

两个酶切位点相邻或没有共同buffer的,通常单切,即先做一种酶切,乙醇沉淀,再做另一种酶切。

 

3.酶切底物DNA,切不开

1)底物DNA上没有相应的限制酶识别位点,或酶切位点被甲基化。

2PCR引物的酶切位点前没有保护碱基或引物合成有误,致使没有正确的酶切位点存在。PCR产物酶切前尽量进行精制以更换buffer。由于PCR产物中带入的其它物质,会影响酶切,据报道,通常PCR产物的添加量占总反应体积25%以下没有问题。

3)酶切条件的确认,包括反应温度和反应体系等。同样的DNA,同样量,用不同的限制酶切情况可能不同,由于DNA的空间结构造成的。同样的DNA,不同的反应体系,酶切效果也可能不同,由于一些空间因素或不可测因素造成的。

4)公司出售的限制酶都是液体状态,都是根据最佳反应体系配制了浓度,不可以再用buffer稀释,因为酶浓度和活性之间不呈直线对应关系,酶浓度越稀,相对活性越低,并且越不稳定,有时便会出现底物DNA不能被切断的现象。

不同公司的酶和buffer不要交叉使用,否则可能会影响酶切效果。

5)酶的识别位点上的碱基被甲基化。可以选用不受甲基化影响的同裂酶,或将质粒DNA转入甲基化酶欠损的宿主菌中,重新制备DNA,也可以使用PCR的方法对DNA进行扩增,再做酶切。常用的有XbaI容易受甲基化影响,通常选用GM33做宿主菌转化。

6)底物不纯,含有限制酶阻害物质,影响酶切作用,需要重新纯化DNA。一般做乙醇沉淀纯化即可。如果质粒中含盐或酚等,都会影响酶切效果。

 

4.DNA经酶切后,电泳无带或出现smear现象

DNA或酶切试剂中混有DNase,在一定的温度或缓冲液的作用下,激发DNase的作用,将DNA降解。可以用DNA上的其他酶,也可以用此酶切其他DNA来检查问题所在。如果质粒酶切出现此情况,首先将质粒做乙醇沉淀再酶切。

 

5.甲基化酶

M.Alu I, M.Bam H I,  M.RcoR I不属于CG甲基化,dam甲基化,也不属于dcm甲基化。

甲基化酶作用后,DNA不能被相应的酶切断。

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