酶不同，所需要的酶切位点的保护碱基的数量也不同。一般情况下，在酶切位点以外多出3个碱基即可满足几乎所有限制酶的酶切要求。在资料上查不到的，我们一般都随便加3个碱基做保护。
寡核苷酸近末端位点的酶切
(Cleavage Close tothe End of DNA Fragments (oligonucleotides)
为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。
实验方法：用γ-[32P]ATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下标记0.1A260单位的寡核苷酸。取1 µg已标记了的寡核苷酸与20单位的内切酶，在20°C条件下分别反应2小时和20小时。反应缓冲液含70 mMTris-HCl (pH 7.6), 10 mMMgCl2 , 5 mM DTT及适量的NaCl或KCl（视酶的具体要求而定）。20%的PAGE（7 M尿素）凝胶电泳分析，经放射自显影确定酶切百分率。
本实验采用自连接的寡核苷酸作为对照。若底物有较长的回文结构，切割效率则可能因为出现发夹结构而降低。
| 酶 |
寡核苷酸序列 |
链长 |
切割率% |
|
|
2 hr |
20 hr |
|||
| Acc I |
GGTCGACC CGGTCGACCG CCGGTCGACCGG |
8 10 12 |
0 0 0 |
0 0 0 |
| Afl III |
CACATGTG CCACATGTGG CCCACATGTGGG |
8 10 12 |
0 90 >90 |
0 90 >90 |
| Asc I |
GGCGCGCC AGGCGCGCCT TTGGCGCGCCAA |
8 10 12 |
>90 >90 >90 |
>90 >90 >90 |
| Ava I |
CCCCGGGG CCCCCGGGGG TCCCCCGGGGGA |
8 10 12 |
50 90 >90 |
>90 >90 >90 |
| BamH I |
CGGATCCG CGGGATCCCG CGCGGATCCGCG |
8 10 12 |
10 90 >90 |
25 90 >90 |
| Bgl II |
CAGATCTG GAAGATCTTC GGAAGATCTTCC |
8 10 12 |
0 75 25 |
0 90 >90 |
| BssH II |
GGCGCGCC AGGCGCGCCT TTGGCGCGCCAA |
8 10 12 |
0 0 50 |
0 0 >90 |
| BstE II |
GGGT(A/T)ACCC |
9 |
0 |
10 |
| BstX I |
AACTGCAGAACCAATGCATTGG AAAACTGCAGCCAATGCATTGGAA CTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT |
22 24 27 |
0 25 25 |
0 50 >90 |
| Cla I |
CATCGATG GATCGATC CCATCGATGG CCCATCGATGGG |
8 8 10 12 |
0 0 90 50 |
0 0 90 50 |
| EcoR I |
GGAATTCC CGGAATTCCG CCGGAATTCCGG |
8 10 12 |
>90 >90 >90 |
>90 >90 >90 |
| Hae III |
GGGGCCCC AGCGGCCGCT TTGCGGCCGCAA |
8 10 12 |
>90 >90 >90 |
>90 >90 >90 |
| Hind III |
CAAGCTTG CCAAGCTTGG CCCAAGCTTGGG |
8 10 12 |
0 0 10 |
0 0 75 |
| Kpn I |
GGGTACCC GGGGTACCCC CGGGGTACCCCG |
8 10 12 |
0 >90 >90 |
0 >90 >90 |
| Mlu I |
GACGCGTC CGACGCGTCG |
8 10 |
0 25 |
0 50 |
| Nco I |
CCCATGGG CATGCCATGGCATG |
8 14 |
0 50 |
0 75 |
| Nde I |
CCATATGG CCCATATGGG CGCCATATGGCG GGGTTTCATATGAAACCC GGAATTCCATATGGAATTCC GGGAATTCCATATGGAATTCCC |
8 10 12 18 20 22 |
0 0 0 0 75 75 |
0 0 0 0 >90 >90 |
| Nhe I |
GGCTAGCC CGGCTAGCCG CTAGCTAGCTAG |
8 10 12 |
0 10 10 |
0 25 50 |
| Not I |
TTGCGGCCGCAA ATTTGCGGCCGCTTTA AAATATGCGGCCGCTATAAA ATAAGAATGCGGCCGCTAAACTAT AAGGAAAAAAGCGGCCGCAAAAGGAAAA |
12 16 20 24 28 |
0 10 10 25 25 |
0 10 10 90 >90 |
| Nsi I |
TGCATGCATGCA |
12 |
10 |
>90 |
| Pac I |
TTAATTAA GTTAATTAAC CCTTAATTAAGG |
8 10 12 |
0 0 0 |
0 25 >90 |
| Pme I |
GTTTAAAC GGTTTAAACC GGGTTTAAACCC AGCTTTGTTTAAACGGCGCGCCGG |
8 10 12 24 |
0 0 0 75 |
0 25 50 >90 |
| Pst I |
GCTGCAGC TGCACTGCAGTGCA AACTGCAGAACCAATGCATTGG AAAACTGCAGCCAATGCATTGGAA CTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT |
8 14 22 24 26 |
0 10 >90 >90 0 |
0 10 >90 >90 0 |
| Pvu I |
CCGATCGG ATCGATCGAT TCGCGATCGCGA |
8 10 12 |
0 10 0 |
0 25 10 |
| Sac I |
CGAGCTCG |
8 |
10 |
10 |
| Sac II |
GCCGCGGC TCCCCGCGGGGA |
8 12 |
0 50 |
0 >90 |
| Sal I |
GTCGACGTCAAAAGGCCATAGCGGCCGC GCGTCGACGTCTTGGCCATAGCGGCCGCGG ACGCGTCGACGTCGGCCATAGCGGCCGCGGAA |
28 30 32 |
0 10 10 |
0 50 75 |
| Sca I |
GAGTACTC AAAAGTACTTTT |
8 12 |
10 75 |
25 75 |
| Sma I |
CCCGGG CCCCGGGG CCCCCGGGGG TCCCCCGGGGGA |
6 8 10 12 |
0 0 10 >90 |
10 10 50 >90 |
| Spe I |
GACTAGTC GGACTAGTCC CGGACTAGTCCG CTAGACTAGTCTAG |
8 10 12 14 |
10 10 0 0 |
>90 >90 50 50 |
| Sph I |
GGCATGCC CATGCATGCATG ACATGCATGCATGT |
8 12 14 |
0 0 10 |
0 25 50 |
| Stu I |
AAGGCCTT GAAGGCCTTC AAAAGGCCTTTT |
8 10 12 |
>90 >90 >90 |
>90 >90 >90 |
| Xba I |
CTCTAGAG GCTCTAGAGC TGCTCTAGAGCA CTAGTCTAGACTAG |
8 10 12 14 |
0 >90 75 75 |
0 >90 >90 >90 |
| Xho I |
CCTCGAGG CCCTCGAGGG CCGCTCGAGCGG |
8 10 12 |
0 10 10 |
0 25 75 |
| Xma I |
CCCCGGGG CCCCCGGGGG CCCCCCGGGGGG TCCCCCCGGGGGGA |
8 10 12 14 |
0 25 50 >90 |
0 75 >90 >90 |
2.双酶切的问题
参看目录，选择共同的buffer。其实，双酶切选哪种buffer是实验的结果，takara公司从1979年开始生产限制酶以来，做了大量的基础实验，也积累了很多经验，目录中所推荐的双酶切buffer完全是依据具体实验结果得到的。
有共同buffer的，通常按照常规的酶切体系，在37℃进行同步酶切。但BamHI在37℃下有时表现出star活性，常用30℃单切。
两个酶切位点相邻或没有共同buffer的，通常单切，即先做一种酶切，乙醇沉淀，再做另一种酶切。
3.酶切底物DNA，切不开
1）底物DNA上没有相应的限制酶识别位点，或酶切位点被甲基化。
2）PCR引物的酶切位点前没有保护碱基或引物合成有误，致使没有正确的酶切位点存在。PCR产物酶切前尽量进行精制以更换buffer。由于PCR产物中带入的其它物质，会影响酶切，据报道，通常PCR产物的添加量占总反应体积25%以下没有问题。
3）酶切条件的确认，包括反应温度和反应体系等。同样的DNA，同样量，用不同的限制酶切情况可能不同，由于DNA的空间结构造成的。同样的DNA，不同的反应体系，酶切效果也可能不同，由于一些空间因素或不可测因素造成的。
4）公司出售的限制酶都是液体状态，都是根据最佳反应体系配制了浓度，不可以再用buffer稀释，因为酶浓度和活性之间不呈直线对应关系，酶浓度越稀，相对活性越低，并且越不稳定，有时便会出现底物DNA不能被切断的现象。
不同公司的酶和buffer不要交叉使用，否则可能会影响酶切效果。
5）酶的识别位点上的碱基被甲基化。可以选用不受甲基化影响的同裂酶，或将质粒DNA转入甲基化酶欠损的宿主菌中，重新制备DNA，也可以使用PCR的方法对DNA进行扩增，再做酶切。常用的有XbaI容易受甲基化影响，通常选用GM33做宿主菌转化。
6）底物不纯，含有限制酶阻害物质，影响酶切作用，需要重新纯化DNA。一般做乙醇沉淀纯化即可。如果质粒中含盐或酚等，都会影响酶切效果。
4.DNA经酶切后，电泳无带或出现smear现象
DNA或酶切试剂中混有DNase，在一定的温度或缓冲液的作用下，激发DNase的作用，将DNA降解。可以用DNA上的其他酶，也可以用此酶切其他DNA来检查问题所在。如果质粒酶切出现此情况，首先将质粒做乙醇沉淀再酶切。
5.甲基化酶
M.Alu I, M.Bam H I, M.RcoR I不属于CG甲基化，dam甲基化，也不属于dcm甲基化。
甲基化酶作用后，DNA不能被相应的酶切断。
请问大佬，KpnI和XbaI这两个酶切位点两边加保护碱基时一定要加上面表格里的吗，可以自己设计加哪些碱基吗，左右两边不互补配对可以吗，问题有点多，望解答，万分感谢！
希望能看到更多分子克隆的技术贴，这个先收藏了师兄
看你有什么需要要？我分享的都是一般我会涉及的，有需要可以留言，我看看有没有能力分享
请问大佬，我用KPnI和SacI作为两个酶切位点，但是SacI的保护碱基前后只有一个，可以吗还是说还能加一些保护碱基，请问怎么加呢
您好，这个是前人总结的，主要是在5’端添加，没有什么特别的原则 只能试试，具体我也不是很清楚
保护碱基是酶切位点两边都要加吗？
对的，都需要的，当然主要是5‘
大佬太强了！特别是这个网页做的太好了。
您过奖啦，有需要一起讨论
有小伙伴知道，没有在这上面列出来的酶切位点的保护碱基，要怎么添加吗
对于部分酶，在两端加2个碱基即可，而部分需要更多，因此，保险起见，在识别位点两端至少加上6个保护碱基（任意），以确保酶切反应的进行
太棒了
收藏
谢谢分享