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双荧光素酶报告基因测试系统(DLR)

       DLR 测试系统灵敏,方便,在一个系统中用于测量两个单独的荧光素酶报告基因,萤火虫荧光素酶及海洋海肾荧光素酶(Renilla reniformis) ,DLR测试系统可用于细胞裂解物及无细胞的翻译系统。

 

荧光素酶技术流程

1.启动子的预测
       启动子是指RNA聚合酶识别并结合的DNA序列,并包括促进这一过程的调节蛋白的结合位点。启动子位于转录起始位点附近,而真核基因的转录起始位点通常需要实验进行确定。5’RACE是确定基因转录起始位点的经典方法。

      在不知道转录起始位点时,我们也可以对启动子进行预测。预测基因启动子的软件有:NCBI promoter scan (http://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/proscan/)等。

2.转录因子的预测
     通常我们比较关心哪些转录因子可以调控我们感兴趣的基因,这就涉及到该基因的转录因子的预测和鉴定。

     转录因子的预测软件有:
SignalScan http://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/signal/ 

TF search http://www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html 等。
     将待预测的上游调控序列输入进行分析,即可知道该序列中含有哪些转录因子的结合位点。(说明:这两个软件提供的预测结果不够全,有一些转录因子没有被包括其中。

 

3.报告基因质粒的构建
     我们经常使用的质粒载体为PGL-Basic。

     我们要将待分析的启动子序列插入到luciferase基因上游。

     推荐使用kpnI,XhoI,BglII和HindIII这几个酶切位点,但不建议用XhoI和BglII双酶切,因为这两个酶切位点有重合。

     该载体测序用RVP3(正向)和GLP2(反向)。

 

4.实验方法及结果分析

      连续截短确定核心启动子。克隆基因的上游调控序列,做连续的截短,如构建-2000~-1500,-1500~-1000,-1000~-500,-500~0,0~500 一系列克隆,转入细胞,观察荧光素酶活性,以此判断哪一段序列对于该基因的转录活性起关键作用。例如:-2000~-1500和-1500~-1000有很高的活性,而-1000~-500活性很弱,则可判断核心启动子区在-1500~-1000。

      特定转录因子对转录活性的分析。我们构建包含该转录因子的启动子序列(上游调控序列)的报告基因质粒,与转录因子的过表达载体(或RNAi)共转染细胞,观察转染前后报告基因活性的变化。如果转染后报告基因活性发生明显改变,则可判断该转录因子可能调控目的基因的转录。

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