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你是否发现非编码RNA(Non-coding RNA)的研究越来越火热?当一个新发现的miRNA是否对相关疾病有较显著的调控作用,这就需要我们先对它和靶基因的调控关系做一验证,接下来我们就介绍最常用的靶向关系验证方法:双荧光素酶报告基因检测

一. 检测原理

由于miRNA主要通过作用于靶基因的3’UTR起作用,可以将目的基因3’UTR区域构建至载体中报告基因luciferase的后面, 通过比较过表达或者干扰miRNA后,报告基因表达的改变(监测萤光素酶的活性变化)可以定量反映miRNA对目的基因的抑制作用;结合定点突变等方法进一步确定miRNA与靶基因3’UTR的作用位点。

双荧光素酶报告基因检测系统示意图

二. 实验材料

仪器设备:荧光显微镜、CO2培养箱、生物安全柜、低速离心机、 血球计数板 、水浴锅、酶标仪;

统计学处理:GraphPad Prism作图

三. 实验步骤

主要分为:质粒转染细胞→双报告基因检测→统计学分析。

质粒转染细胞:  

1、细胞铺板:将细胞按70%的汇合度接种到96孔板。

2、转染:16小时后转染萤光素酶报告基因质粒和RNA,每个样品设置6个复孔。

1) 配制DNA和转染试剂: 96孔板转染质粒时每孔比例Firefly:Renilla:转染试剂=0.1μg:0.01μg:0.25μl;

2) 配制RNA和转染试剂稀释液,RNA的终浓度为100nM,转染试 剂每孔0.25μL; 

3) 稀释好的DNA和RNA及转染试剂,常温孵育5min;

4) 将稀释好的DNA和RNA分别和转染试剂混匀,常温孵育20min;

5) 每孔弃去50ul培养基,将25μL DNA转染混合液和25uL RNA转 染混合液分别添加到每孔细胞样品中;

6) 转染6小时后,换新鲜完全培养基。

 双报告基因检测:

1、质粒共转染48小时后,弃去培养基,用100μl 1XPBS洗1遍;

2、 倾斜96孔板,吸干剩余的PBS;

3、去离子水将5XPLB稀释成1XPLB,使用前放到常温;

4、每孔加50μl稀释好的 1X PLB,摇床常温条件下摇15min,进行裂 解;

5、白色不透光的96孔酶标板中每孔加步骤4的上清液10μl, 加入100 μl预先混好的LAR II,2s后测数据;

6、每孔添加100μl预先混好的Stop&Glo Reagent,静止2s后,测数 据  注意:进行Luciferase活性检测时,需在避光条件下进行。

One Reply to “手把手教你双荧光素酶检测实验!”

  1. 王老师请问 2s后检测荧光素荧光,需要单个样本依次上机检测么?还是多个样本同时加样LAR2 再进行检测呢? 每个样本检测时长时多少s?谢谢!期待您的回复

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