Posted on

https://www.beyotime.com/cpimages/image/mutagenesis-final.jpg

图1.基因定点突变试剂盒原理图

(碧云天:D0206)

使用说明:
1. 引物设计:
用于特定基因突变的引物需要单独设计,请参考如下一些基本原则进行设计:
a. 共需设计两条互补的引物。可以先集中设计一条,然后就可以得到互补的另一条引物。
b. 引物的长度通常为25-45个碱基。
c. 利用如下公式进行引物Tm值的估算,通常Tm值应该不低于78℃。
Tm = 81.5 + 0.41(%GC) – (675/N) – %mismatch
N表示引物所含碱基总数
%GC表示引物中GC碱基数占引物总碱基数的百分值,例如GC含量为50%,那么%GC就是50。
%mismatch表示引物中突变碱基数占引物总碱基数的百分值,例如错配率是2.5%,那么%mismatch就是2.5。
例一:对于模板序列5′-CCAATTTCGAGGAATTAGAACCTTATTTTGAACTTACTGAAGG-3’,其中带有灰色阴影的A为待突变位点,需要突变为C,设计正向突变引物如下:
5′-CCAATTTCGAGGAATTAGCACCTTATTTTGAACTTACTGAAGG-3′
Tm = 81.5 + 0.41*(15/43)*100 – (675/43) – (1/43)*100 = 77.8
例二:对于模板序列5′-GGGAGCTCACCAAGCTGAAGAGCACCTACATTGA-3’,其中两个有灰色阴影的A为待突变位点,均需要突变为G,设计正向突变引物如下:
5′-GGGAGCTCACCAGGCTGAGGAGCACCTACATTGA-3′
Tm = 81.5 + 0.41*(20/34)*100 – (675/34) – (2/34)*100 = 79.9
对于插入、缺失型的突变引物,推荐利用如下公式进行引物Tm值的估算:
Tm=81.5 + 0.41(%GC) ‒ (675/N)
此公式中,N不包含插入或缺失的碱基。因为如果N包含插入或缺失的碱基,数字可能会比较大,从而影响计算结果。
d. 也可以利用如下公式进行引物设计。
引物中突变位点任何一侧都必需满足4*(GC碱基数) + 2*(AT碱基数) ≥ 45。但引物也不宜过长,否则通常会形成非常稳定的二级结构。通常把突变位点两侧的碱基数控制在15个左右,且使两侧按照上述计算得到的数值相近。
例如引物为AGTCAGGCCAATTCGAAGCAGTCGAATTGCCAAG,其中有灰色阴影的AAG为突变位点,则
左侧:4*(GC碱基数) + 2*(AT碱基数) = 4*8 + 2*7 = 46 ≥ 45
右侧:4*(GC碱基数) + 2*(AT碱基数) = 4*8 + 2*8 = 48 ≥ 45
e. 上述c和d这两种方法的计算标准有较明显的差异,但经过多次测试,两种方法都可以顺利获得预期的突变。
f. 在可能的情况下,尽量把引物的GC含量控制在40-60%。
g. 在可能的情况下,尽量使引物不要产生非常稳定的二级结构和引物二聚体。二级结构和二聚体可通过一些软件进行分析。
h. 最好使用经过PAGE纯化的引物或更高纯度的引物。
2. 引物的配制:
如果合成得到的一个引物A的量是20nmol,另外一个互补引物B的量是19nmol。在引物A中加入200μl水,配制成浓度为100μM,在引物B中加入190μl水也配制成浓度为100μM。吸取20μl 100μM引物A和20μl 100μM引物B到一新的离心管中,再加入160μl水,混匀后即可得到可以直接用于基因定点突变反应的引物(10μM each)。
3. 待突变模板质粒的选择:
选择GC含量在40-55%的待突变模板质粒,并且每一个50bp左右的局部GC含量最好也不超过70%。如果GC含量过高,请先把目的基因克隆到其它合适的载体上,再进行基因定点突变反应。另外目的基因GC含量最好也在40-55%的范围,并且每一个50bp左右的局部GC含量最好也不超过70%。如果目的基因GC含量过高,而突变位点不在高GC含量区域,可以先把该基因的不含高GC含量的一个区域克隆出来,进行定点突变,然后再把突变后的片断克隆回原基因中。如果必需使用高GC含量的质粒模板,或者有局部高GC含量的质粒模板,请另外使用专门用于高GC含量模板的PCR反应试剂。
必须使用从dam+的大肠杆菌(这类菌中质粒可以被甲基化)中抽提得到的质粒用于基因定点突变。常用的大部分大肠杆菌都是dam+的,包括DH5α、JM109等。
4. 基因定点突变反应:
a. 如下设置基因定点突变反应体系:

  扩增片段小于6kb 扩增片段大于6kb
试剂 最终浓度 体积 最终浓度 体积
Nuclease-Free Water ?μl ?μl
10X BeyoFusion™ Buffer (with Mg2+) 1X 5μl 1X 5μl
引物混合物(10μM each) 0.4μM each 2μl 0.8μM each 4μl
dNTP mix (2.5mM each) 0.25mM each 5μl 0.5mM each 10μl
待突变模板质粒 200ng ?μl 200ng ?μl
BeyoFusion™ DNA Polymerase 1/50 1μl 1/50 ?1μl
总体积 50μl 50μl

按照上面的顺序依次加入各种试剂。在上述反应体系中,根据待突变模板质粒的量,计算出需加入的Nuclease-Free Water的量,使总体积为49μl。适当混匀后,加入1μlBeyoFusion™ DNA Polymerase,混匀。如果用的PCR仪没有热盖,在反应体系上加入一滴矿物油(mineral oil)以防止蒸发。
b. 按照如下参数设置PCR仪:

步骤 循环数 温度 <6kb时的时间 >6kb时的时间 说明
1 1 95℃ 3min 3min 最初变性
2 20 95℃ 30sec 30sec 变性
55℃ 30sec 30sec 退火
68℃ 30sec/kb 60sec/kb 延伸
3 1 68℃ 10min 15min 延伸、补全
4 1 4℃ 长时间保持 长时间保持 暂时存放

说明:上面表格中30sec/kb表示,如果待突变的质粒为6kb,那么68℃的延伸时间为3分钟。60sec/kb的含义相同。
5. DpnI消化:
PCR反应后,直接在PCR反应体系中加入1μl DpnI,混匀后37℃孵育5min。37℃孵育可以在PCR仪上进行,也可以在水浴锅中进行。DpnI消化完毕后可以直接用于转化,或者-20℃保存备用。
6. 转化、挑克隆鉴定:
感受态细菌的转化效率必需至少在107以上,否则很难得到克隆。根据所使用的感受态细菌,加入尽量多的经过DpnI消化后的突变产物用于转化。通常每100μl感受态细菌中可以加入5-10μl经过DpnI消化后的突变产物。按照所使用的感受态细菌的操作方法进行操作,在涂板前通过离心浓缩的办法,把所有被转化后的细菌,全部涂布到含有适当抗生素的平板上,培养过夜。通常会得到100个以下的克隆。如果发现有上千个克隆,那么通常是有什么地方出了问题。
对于得到的克隆,可以挑取3-5个克隆送样测序去测序,以确认得到的克隆是否是预期的突变克隆。通常大部分的是预期的突变克隆。但有时也可能会因为随机因素,会测序了3-5个克隆才得到一个预期的突变克隆。

常见问题:
1. 转化后没有克隆或克隆数极少:
a. 感受态细菌效率不够高,请检测一下感受态细胞的效率,确保转化效率在107以上,当然高一些更好。
b. 把DpnI消化后的产物用常规的乙醇沉淀方法进行沉淀,然后溶解在较小的体积中。这样就可以把所有的产物全部用于转化。
c. 优化基因定点突变中的PCR参数。可以把最初的95℃变性时间延长为5min,循环中95℃变性的时间延长至1min,把循环中的68℃的延伸时间改为1min/kb 至2min/kb,退火可以改为60-55℃或65-55℃等的touch down,退火时间也可以适当延长。
d. 引物设计有问题。通过突变反应中的PCR没有很好地扩增出预期的突变质粒。
e. 如果使用矿物油(mineral oil),在转化时如果把矿物油带入感受态菌,会严重影响转化效率。
2. 有克隆,但没有或很难检测到预期的突变克隆:
a. DpnI消化效果不佳。一种可能是加入DpnI后,由于该酶在甘油中,会迅速下沉,如果没有混匀就会严重影响DpnI的消化作用。另一种可能是DpnI由于保存不当或保存时间过长等原因导致活性下降,这时可以适当延长消化的时间至1-2小时。
b. 使用的待突变的模板质粒量过多,导致DpnI消化时不完全。我们这里推荐的模板质粒用量0.5μg,已经是模板质粒用量的上限,不能再使用更多的模板质粒了。
c. 尽量避免多次反复冻融dNTP。可以把dNTP适当分装后再使用。
3. 有突变克隆,但突变位点不是预期的位点:
a. 引物设计不佳,并且PCR反应中退火温度过低,导致引物退火到错误的地方。
b. 引物质量较差,没有经过PAGE纯化。这样引物中通常会含有比设计的引物要短的特异性较差的引物,容易导致非预期的突变。

发表评论

邮箱地址不会被公开。 必填项已用*标注