摘要

血管生成不仅涉及包括癌症生物学和非肿瘤疾病在内的病理状况，还涉及许多生物过程，包括繁殖，发育和修复。在血管生成期间，内皮细胞（EC）在血管生成因子与其受体结合，释放蛋白酶以溶解基底膜，向血管生成信号迁移，增殖和新血管形成的细胞数量增加后经历活化。最后，EC的重组形成三维脉管系统。当在生长因子减少的基底膜提取物的凝胶上培养时，HUVEC管形成测定是基于EC形成三维毛细血管样管状结构的能力的简单但完善的体外血管生成测定之一。在测定期间，EC分化，定向迁移以对齐，分支并形成血管的管状多边形网络。

材料和试剂

1. 靶细胞系可以是具有和不具有药物处理或表达目标基因的细胞系。
   注意：我们的实施例包括被设计为具有肿瘤抑制基因的诱导型表达的四种细胞系和相应的单独载体对照。。
2. 生长因子减少的BD Matrigel（BD Biosciences，目录号：354230）
3. Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）（高葡萄糖L-谷氨酰胺，500ml）（Life Technologies，Invitrogen TM，目录号：11965-092）
4. 胎牛血清（Life Technologies，Invitrogen TM，目录号：26140-079）
5. 原发性人脐静脉内皮细胞（HUVEC）（Life Technologies，Invitrogen TM，目录号：C-003-5C）
6. 培养基200PRF（Life Technologies，Invitrogen TM，目录号：M-200PRF-500）
7. 低血清生长补充剂（LSGS）（Life Technologies，Invitrogen TM，目录号：S-003-10）
8. 条件培养基（CM）

设备

1. 组织培养设置
2. 带数码相机（尼康TMS）的倒置显微镜
3. 从NIH网站下载的Scion Image软件
4. 96孔板
5. 离心机
6. 单元格计数器
7. T75组织培养瓶

步骤

1. 从靶细胞系制备条件培养基
   1. 为了制备条件培养基（CM），种子靶细胞并生长至30-40％汇合（取决于细胞系的生长速率），用无血清DMEM代替生长培养基（例如 10ml 对于T75组织培养瓶;当存在或不存在抗生素时无关紧要）24小时，然后当细胞在T75组织培养瓶中达到60-80％汇合时收获CM。
   2. 使0.5ml等分的CM，并存储在-80°C，如果它不是立即使用后收集CM。
2. 人脐静脉内皮细胞（HUVEC）细胞的制备
   1. 根据产品说明书，用LSGS制备HUVEC Medium 200PRF补充剂。
   2. 种子HUVEC细胞在T25或T75烧瓶中，根据需要，使其达到70-80％汇合第二天。
   3. 在不含抗生素的培养基200PRF（对于T25组织培养瓶，例如5ml）中，在进行管形成测定之前，血清使HUVEC细胞饥饿3-6小时。
      注意：血清饥饿结束时，请转到步骤C第1步。
   4. 在用生长因子减少的Matrigel包被96孔板后，用胰蛋白酶处理从烧瓶表面除去细胞，用血清用DMEM中和，在室温下通过在1,200rpm离心（276×g ）3分钟，重悬于2-3ml无血清DMEM中，通过计数细胞测定HUVEC的浓度，并通过上下吹吸数次以4×10 5/ml无血清DMEM重悬HUVEC细胞次以确保均匀的单细胞悬浮 注意：对于生长因子减少的Matrigel，应尽可能减少解冻/冻结循环。
   5. 充分混匀，同时移取500微升的HUVEC细胞悬浮液到1.5毫升管。使用台式离心机以4,000rpm（1,100rcf）旋转细胞3分钟。小心吸出上清液，不要打扰细胞沉淀。尽可能多地去除上清液。根据要使用的目标细胞系的数量，在1.5毫升管中准备适当数量的HUVEC细胞。
   6. 解冻从程序A步骤2收集的靶细胞系的CM的0.5ml等分试样，并用胎牛血清补充至终浓度为1％，以在程序B步骤5中重悬HUVEC细胞沉淀。
      注意：每个靶细胞系应该重复三次（每个孔需要100μl的HUVEC细胞悬浮液）。
3. 用生长因子减少的Matrigel涂覆96孔板
   1. 在使用前一天在4℃下融化适当体积的生长因子减少的Matrigel
   2. 预冷96孔板和移液器吸头在-20°C 2-3小时
   3. 接近HUVEC细胞的血清饥饿结束并且在计数HUVEC细胞之前，在冰上将预冷的96孔板的每孔等分50μl生长因子减少的Matrigel。旋转板直到凝胶均匀分布在整个孔上。避免气泡形成是非常重要的。使其在室温下在水平表面上聚合1小时
4. 将HUVEC细胞分配到涂覆的96孔板中
   1. 将100μl在程序B步骤6中获得的HUVEC细胞悬浮液充分混合到96孔板的标记孔中。将板在37℃，5％CO 2孵育4-6小时
   2. 使用光学显微镜可视化细胞。拍摄毛细管网络的图像，并使用Scion Image软件计算管长度。
      
      
      

致谢

该协议基于来自以前出版物的修改建立：Chan等人（2011）和Kong等人（2007）。

参考文献

1. Chan，KC，Ko，JM，Lung，HL，Sedlacek，R.，Zhang，ZF，Luo，DZ，Feng，ZB，Chen，S.，Chen，H.，Chan，KW，Tsao，SW，Chua，DT ，Zabarovsky，ER，Stanbridge，EJ和Lung，ML（2011）。 基质金属蛋白酶-19的催化活性对于鼻咽癌中的肿瘤抑制基因和抗血管生成活性是必需的。 Int J Cancer 129（8）：1826-1837。
2. Kong，D.，Li，Y.，Wang，Z.，Banerjee，S。和Sarkar，F.H。（2007）。 抑制血管生成和3,3′-二吲哚基甲烷的侵袭是由核因子kappaB下游介导的 目标基因MMP-9和uPA，其调节前列腺癌中血管内皮生长因子的生物利用度。 Cancer Res 67（7）：3310-3319。

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英文原文见下页