要了解同源双交换必须掌握同源重组，因为同源双交换就是进行了两次同源重组。
概念：同源重组是指两个DNA分子之间拥有相同/相似碱基顺序的片段（同源序列/同源性较高的序列）位置发生序列交换，同源重组依赖于序列的同源性。
！！！注意两点： ① 同源性和特异性是两个不同概念；② 交换发生在序列相同或相似的具体位置，而非两个DNA分子之间全部交换。
发生同源重组的几个条件：
1. 重组交换区含有相同或相似的碱基序列；
2. 两个分子之间要相互靠近，发生联会，之后发生互补配对；
3.需要重组酶催化，体内通常不需要另外添加，体外重组要加重组酶。
体内同源重组自然发生，只要了解意思就行；体外同源重组，很多公司都有重组酶卖的，什么一步克隆、无缝克隆大多是利用重组酶进行克隆，难就难在引物设计（以后再讲）。目前解释同源重组的模型有三种：Holiday模型、单链断裂模型、双链断裂模型，我们只要知道序列相同和相似位置发生交换即可。（这几个模型也好理解，需要了解的同学自己去查）
这里主要解析同源双交换，毕竟很多学生硕士毕业甚至都没太搞懂。
同源双交换敲除实验详细解析：
1. 基因上下游同源臂设计（也有实验室叫基因外部同源臂、基因左右同源臂、F端/R端同源臂）
在待敲除基因上下游分别选取一段150-500bp左右的片段，以其作为上下游同源臂模板进行引物设计。上游同源臂正向和反向引物可命名为LF和LR，下游同源臂正向和反向引物可命名为RF和RR。（一共4条引物）在LF的5’加上载体双酶切时的一个酶切位点，在RR的5’端载入体双酶切时另一个酶切位点，在LR和RF的5’端分别加上相同的酶切位点（由你自己设计）。（至于保护碱基和具体怎么选酶，先自己学习一下，或者等以后的帖）
2. 普通PCR将片段扩增出来
以宿主DNA为模板，分别以LF/LR（一组）和RF/RR（一组）进行PCR扩增，之后纯化，酶切（将模板也进行酶切），再纯化，连接。
3. 将连接产物转化进大肠杆菌中
将连接产物转入感受态中，抗生素筛选，送测序。将测序成功的克隆进行培养，提取质粒。
4. 质粒转化/转染
真核生物里一般叫转染，可以化转也可以电转；在原核生物中一般称为转化，可以化转也可以电转，还有一些病原菌可以进行三亲本结合进行接合。
5.质粒与宿主DNA发生联会
6. 第一次筛选（重组）
如果用我示意图的载体，选用Amp抗生素进行筛选，筛选出发生了一次重组的中间体。注意碱基序列方向。
7. 第二次筛选（重组）
在培养基中加入蔗糖，蔗糖存在情况下，存在sacB基因的宿主会致死（自杀），在这样的压力下，发生第二次重组，未发生第二次重组的中间体死亡。就可以得到敲除基因的克隆。
图析：
说明：
1.第一次重组并非一定先发生在L臂，L/R臂都有可能，但是谁先谁后不影响两次重组后的结果；
2.部分宿主内，每次重组并非都是全部交换，而是随机的，具体看宿主本身的重组酶类型，但无论如何交换都不影响敲除效果，只影响敲除后L臂和R臂剩余多少在宿主中，如下图展示L臂部分重组；
3.部分宿主配合部分载体可以一次筛选出敲除单克隆，但其还是发生过两次重组，才能得到敲除基因片段的单克隆（必须一次次交换才有意义，只不过在第一次筛选是抗生素直接加两种，但不是sacB类载体）。
请问下质粒导入细菌后，用抗生素筛，阳性的细菌如何保证质粒一定通过第一次同源交换整合到基因组上了呢？是要通过菌落PCR筛吗？（如果是，整合的机会有多大呢？）还是有什么其他办法？
我想表达的是质粒存在与细菌内部，或者它整合到基因组上，抗生素筛出来都是阳性的吧？
老师您好，我想问一下第一步PCR验证是交换上了，蔗糖压力筛选又都死了是怎么回事。总不会是同源臂方向弄反了吧
我用这个方法去敲除，突变体p c r验证既有抗性基因片段，又有目的基因片段是怎么回事，有办法解决吗
老师，您好，我想做酵母基因的敲除，能用这个方法吗？我想敲除的基因在NCBI上的序列就是完整的CDS序列，设计上下游同源臂就只能在基因的开头和末尾设计，这样可以吗？
王老师，我使用上下游个1000bp来敲除铜绿假单胞菌的基因，经PCR鉴定，在第二次交换后得到的菌落全部是野生型，想请求老师帮忙分析下原因！！
第一次重组与第二次重组还是不太懂，尤其抗生素标签 最后是怎么去除的呀. 同源臂上游与下游为什么需要用同一种相同的限制性核酸内切酶呀
请问老师，这种基因敲除方法只需要构建目的基因两端的上下游同源臂然后按顺序连接到载体上转化进入目的菌内就可以了是吗?我看到另一种方法是在上下游同源臂之间加入一段抗性基因，那么如果使用这种方法，如果进行第一第二次的重组筛选呢？是先用载体本身抗性进行一次筛选，然后使用连接的抗性片段进行二次筛选/直接使用双抗培养基一次性筛选?
老师您好，我想找到我的目的基因的启动子，利用过表达原理做回补，请问怎么找我目的基因的启动子序列呢
您好，请问如何做回补实验呢，我想找到我的目的基因的启动子，利用过表达原理做回补，请问怎么找我目的基因的启动子序列呢
一定要用环状质粒进行两次交换吗，用：左臂——筛选标记——右臂，这样的线性序列一步整合到受体基因组中可行吗？我做的是真菌，查阅的论文中他的示意图基本都是一步双交换，而且也没有两步筛选。
老师您好，请问酵母可以只设计单同源臂只含上游同源臂进行基因导入吗？
我找了好久才在您这边找到我想要的答案，太感谢王老师了
老师您好，最近也在做这个实验，对于载体方面选择您有心得吗，因为我目前用的是四环素的载体，感觉后续细菌长势以及摇菌后浓度都不理想，想问问您载体方面选择您有什么建议吗
老师您好，我想请问一下我用的载体是温敏自杀质粒，单交换验证可以使用载体上的一段序列进行验证吗？
你好请问一次转化子获得后，后续用蔗糖平板筛选二次重组，总是回到野生型怎么解决
老师您好，我最近在做将外源基因片段插入酿酒酵母菌染色体里，没有找到具体的操作方案，可以大概解答一下吗？麻烦您啦
第一次筛选重组的那个图是不是有点问题啊
老师，我用两端引物鉴定是敲掉了，但是用内部引物鉴定发现没有敲掉，这是为什么
师兄，想请教一下，同源重组双交换可以完成基因的替换吗，将基因组上的某个基因用载体上的另外一个基因替换掉，这样可行吗？谢谢。
您好，想问一下，同时敲除多个基因的话，用同源重组的办法，是把多个基因构建到同一个质粒上再转化吗
您好，不好意思，这个不太清楚，建议还是一个个做比较好，或者两个质粒同时转 然后筛
你好我想进您的基因编辑讨论群可以吗 方便吗
您好，想问一下，同时敲除多个基因的话，用同源重组的办法，是把多个基因构建到同一个质粒上再转化吗
老师，我第一步构建好的质粒转导我的目的菌株，采用电转。然后选平板菌鉴定的时候，引物选的上游F和下游R，PCR结果为什么只有一条带啊？理论上不应该是两条带吗？
请问您这个怎么筛选单交换的呢？我们做的是分枝杆菌基因敲除，单交换在平板上7天才长出来，不是很清楚怎么确定单交换是否成功
老师，同源臂上没加酶切位点，对后面筛选会有影响吗？
你指的是xbal？这是为了把上下游同源臂连起来，也可以通过同源重组连接
老师好，我做的是真核生物中真菌的基因敲除，用的是同源重组的办法，上下游臂长度都是500多bp，这样的长度合适嘛？谢谢老师
可以的，可以短一点，问题不大
老师你好，我也是丝状真菌基因敲除，采用peg介导方式，上下游臂700，抗性基因选择g418.敲除目的基因2000bp，但现在筛选出来的转化子，全是有抗性基因的，但目的基因还在，感觉很奇怪？上下游臂发生交换的位置，对碱基的组合有什么特殊要求吗？
请问老师，如果只要第一次同源重组的阳性克隆可以吗，后续没有选择压力整合片段会丢失吗
你好，得到阳性克隆之后，培养过程中质粒有可能丢失的，还是加压吧
请问老师，像大豆这种真核生物的基因也可以利用同源重组进行基因敲除吗？
你好，当然可以的 可以结合crispr
请问老师可以出一期类似都教程吗？最近在寻找比较高效的植物基因敲除方法但是一直没有头绪
你好，我用L臂5’端前大约100bp处的基因组上的引物作为F，需要插入的基因的3‘端作为R可获得大小及测序正确的条带，用R臂3’端后大约100bp的基因组上的引物作为R’，需要插入的基因的5‘端作为F’可获得大小及测序正确的条带，理论上来说我是已经获得正确的替换菌株了，但是用F和R’进行菌p的条带还是野生型，我实在困惑？
你好，我也奇怪，种情况好像只能怀疑菌不纯，有重组成功的，也有野生型的，毕竟PCR这个方法及其灵敏。至于为什么后面只P出野生型的，那可能是PCR的一些偏好性导致的。
如果你有其他解释或者解决了可以留言告诉我
你好老师，我想问在选择上下游作为同源臂时，怎么看会不会影响上下游基因的表达啊。
老师好，同源臂50-500bp左右的片段，那具体有什么设计原则吗，还是说自己随机选取一段就行？
您好！想请问一下如果需要使用同源重组做敲入，存在多个可供敲入的外源模版的情况下是会将之随机敲入吗？与模版的长度是否有关呢？
如果先使用Cas9敲出DSB后再进行重组，是否可以认为“改变”了同源臂的范围，一定程度上提高特异性呢？
非常感谢！
您好，多个模板我没有做过，我的理解是随机敲入，当然会与长度有关，同源臂结合的几率一样，但是重组的几率不一样
用cas9形成DSB为什么会改变同源臂的范围，没明白你的意思，还有什么叫敲出（敲除）DSB？
您好！我的意思大致是，在类似 DOI:10.1038/s41598-017-16998-8 的情景中，如果DSB下游有多个与上游区段同源的序列，那么他们重组的概率是否会与他们同DSB断口的位置有关呢？ 非常感谢！
同求！！！救救孩子吧
是关于鉴定引物设计吗？改天整一下、
老师您好，引物教程出了吗
老师，能不能出一期同源重组敲除基因的引物设计！！！！请求老师帮忙！！
王老师，可不可以讲解一下，第一次重组后，第二次重组后，进行鉴定时，引物如何设计哇！真的很需要！！！请求老师帮忙，不甚感激！！！
王老师，看了您的讲解很受启发，也对同源重组有了更深的理解。现在我做酵母BY4741突变体遇到了问题，即第一次同源重组时，用一缺URA筛选培养基得到的重组酵母菌落，进行基因组提取，用三引物鉴定时，都有带，形成了杂合子，为什么会形成杂合子呢？酵母BY4741不是单倍体吗？请求老师帮忙解答!!!不甚感激！！！
您好，前两天出差开会，没留意网站留言
三引物都出条带说明你的第一次重组成功了，还是我理解错您的意思，还没解决的话可以微信讨论