Posted on

要了解同源双交换必须掌握同源重组,因为同源双交换就是进行了两次同源重组。

概念:同源重组是指两个DNA分子之间拥有相同/相似碱基顺序的片段(同源序列/同源性较高的序列)位置发生序列交换,同源重组依赖于序列的同源性。

!!!注意两点: ① 同源性和特异性是两个不同概念;② 交换发生在序列相同或相似的具体位置,而非两个DNA分子之间全部交换。

发生同源重组的几个条件

1. 重组交换区含有相同或相似的碱基序列;

2. 两个分子之间要相互靠近,发生联会,之后发生互补配对;

3.需要重组酶催化,体内通常不需要另外添加,体外重组要加重组酶。

体内同源重组自然发生,只要了解意思就行;体外同源重组,很多公司都有重组酶卖的,什么一步克隆、无缝克隆大多是利用重组酶进行克隆,难就难在引物设计(以后再讲)。目前解释同源重组的模型有三种:Holiday模型、单链断裂模型、双链断裂模型,我们只要知道序列相同和相似位置发生交换即可。(这几个模型也好理解,需要了解的同学自己去查)

这里主要解析同源双交换,毕竟很多学生硕士毕业甚至都没太搞懂。


同源双交换敲除实验详细解析:

1. 基因上下游同源臂设计(也有实验室叫基因外部同源臂、基因左右同源臂、F端/R端同源臂)

在待敲除基因上下游分别选取一段150-500bp左右的片段,以其作为上下游同源臂模板进行引物设计。上游同源臂正向和反向引物可命名为LF和LR,下游同源臂正向和反向引物可命名为RF和RR。(一共4条引物)在LF的5’加上载体双酶切时的一个酶切位点,在RR的5’端载入体双酶切时另一个酶切位点,在LR和RF的5’端分别加上相同的酶切位点(由你自己设计)。(至于保护碱基和具体怎么选酶,先自己学习一下,或者等以后的帖)

同源重组 同源臂

2. 普通PCR将片段扩增出来

以宿主DNA为模板,分别以LF/LR(一组)和RF/RR(一组)进行PCR扩增,之后纯化,酶切(将模板也进行酶切),再纯化,连接。

3. 将连接产物转化进大肠杆菌中

将连接产物转入感受态中,抗生素筛选,送测序。将测序成功的克隆进行培养,提取质粒。

同源重组 同源臂

4. 质粒转化/转染

真核生物里一般叫转染,可以化转也可以电转;在原核生物中一般称为转化,可以化转也可以电转,还有一些病原菌可以进行三亲本结合进行接合。

5.质粒与宿主DNA发生联会

同源重组 同源臂

6. 第一次筛选(重组)

如果用我示意图的载体,选用Amp抗生素进行筛选,筛选出发生了一次重组的中间体。注意碱基序列方向。

同源重组 同源臂

7. 第二次筛选(重组)

在培养基中加入蔗糖,蔗糖存在情况下,存在sacB基因的宿主会致死(自杀),在这样的压力下,发生第二次重组,未发生第二次重组的中间体死亡。就可以得到敲除基因的克隆。

同源重组 同源臂

图析:

说明:

1.第一次重组并非一定先发生在L臂,L/R臂都有可能,但是谁先谁后不影响两次重组后的结果;

2.部分宿主内,每次重组并非都是全部交换,而是随机的,具体看宿主本身的重组酶类型,但无论如何交换都不影响敲除效果,只影响敲除后L臂和R臂剩余多少在宿主中,如下图展示L臂部分重组;

同源重组 同源臂

3.部分宿主配合部分载体可以一次筛选出敲除单克隆,但其还是发生过两次重组,才能得到敲除基因片段的单克隆(必须一次次交换才有意义,只不过在第一次筛选是抗生素直接加两种,但不是sacB类载体)。

25 Replies to “同源重组敲除基因原理及方法”

  1. 您好,想问一下,同时敲除多个基因的话,用同源重组的办法,是把多个基因构建到同一个质粒上再转化吗

  2. 您好,想问一下,同时敲除多个基因的话,用同源重组的办法,是把多个基因构建到同一个质粒上再转化吗

  3. 老师,我第一步构建好的质粒转导我的目的菌株,采用电转。然后选平板菌鉴定的时候,引物选的上游F和下游R,PCR结果为什么只有一条带啊?理论上不应该是两条带吗?

  4. 老师好,我做的是真核生物中真菌的基因敲除,用的是同源重组的办法,上下游臂长度都是500多bp,这样的长度合适嘛?谢谢老师

  5. 请问老师,如果只要第一次同源重组的阳性克隆可以吗,后续没有选择压力整合片段会丢失吗

  6. 请问老师,像大豆这种真核生物的基因也可以利用同源重组进行基因敲除吗?

      1. 请问老师可以出一期类似都教程吗?最近在寻找比较高效的植物基因敲除方法但是一直没有头绪

  7. 你好,我用L臂5’端前大约100bp处的基因组上的引物作为F,需要插入的基因的3‘端作为R可获得大小及测序正确的条带,用R臂3’端后大约100bp的基因组上的引物作为R’,需要插入的基因的5‘端作为F’可获得大小及测序正确的条带,理论上来说我是已经获得正确的替换菌株了,但是用F和R’进行菌p的条带还是野生型,我实在困惑?

    1. 你好,我也奇怪,种情况好像只能怀疑菌不纯,有重组成功的,也有野生型的,毕竟PCR这个方法及其灵敏。至于为什么后面只P出野生型的,那可能是PCR的一些偏好性导致的。
      如果你有其他解释或者解决了可以留言告诉我

    2. 你好老师,我想问在选择上下游作为同源臂时,怎么看会不会影响上下游基因的表达啊。

  8. 老师好,同源臂50-500bp左右的片段,那具体有什么设计原则吗,还是说自己随机选取一段就行?

  9. 您好!想请问一下如果需要使用同源重组做敲入,存在多个可供敲入的外源模版的情况下是会将之随机敲入吗?与模版的长度是否有关呢?

    如果先使用Cas9敲出DSB后再进行重组,是否可以认为“改变”了同源臂的范围,一定程度上提高特异性呢?
    非常感谢!

    1. 您好,多个模板我没有做过,我的理解是随机敲入,当然会与长度有关,同源臂结合的几率一样,但是重组的几率不一样
      用cas9形成DSB为什么会改变同源臂的范围,没明白你的意思,还有什么叫敲出(敲除)DSB?

      1. 您好!我的意思大致是,在类似 DOI:10.1038/s41598-017-16998-8 的情景中,如果DSB下游有多个与上游区段同源的序列,那么他们重组的概率是否会与他们同DSB断口的位置有关呢? 非常感谢!

  10. 王老师,可不可以讲解一下,第一次重组后,第二次重组后,进行鉴定时,引物如何设计哇!真的很需要!!!请求老师帮忙,不甚感激!!!

  11. 王老师,看了您的讲解很受启发,也对同源重组有了更深的理解。现在我做酵母BY4741突变体遇到了问题,即第一次同源重组时,用一缺URA筛选培养基得到的重组酵母菌落,进行基因组提取,用三引物鉴定时,都有带,形成了杂合子,为什么会形成杂合子呢?酵母BY4741不是单倍体吗?请求老师帮忙解答!!!不甚感激!!!

    1. 您好,前两天出差开会,没留意网站留言
      三引物都出条带说明你的第一次重组成功了,还是我理解错您的意思,还没解决的话可以微信讨论

发表评论

邮箱地址不会被公开。 必填项已用*标注