巨噬细胞属免疫细胞，有多种功能，是研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。巨噬细胞容易获得，便于培养，并可进行纯化。巨噬细胞属不繁殖细胞群，在条件适宜下可生活2－3周，多用做原代培养，难以长期生存。

小鼠腹腔巨噬细胞原代培养的应用：

（1）用于细胞保种；

（2）用于分子生物学研究；

（3）用于基因治疗研究。

1. 实验动物

8-12周龄雌性C57BL6/J小鼠

2. 主要试剂

1）RPMI1640培养基 —— CellMax

2）胰蛋白酶 —— CellMax

3）胎牛血清 —— CellMax

4）双抗 —— CellMax

5）PBS —— CellMax

6）酒精

7）巯基乙醇酸钠

8）台盼兰

9）碘酒

3. 实验准备

1）动物：C57BL6/J小鼠2-4只。

2）试剂：RPMI1640培养基(含酚红)，胎牛血清，双抗，培养液(10%胎牛血清、RPMI1640、双抗)，台盼兰，碘酒绵球和酒精绵球等。

3）器械：一次性注射器、手术器械。

4. 实验步骤

如果采用刺激物，则可在实验前三天腹腔注射3%巯基乙醇酸钠每只2 mL，获得的巨噬细胞数要多一些。不采用刺激物，直接开始下面的步骤。

1） 拉颈处死小鼠，在75%酒精浸泡1-2分钟，移入超净台中，置动物于解剖台上，用针头固定四肢，双手持镊撕开皮肤拉向两侧，暴露出腹膜，但勿伤及腹膜壁。

2） 再用70％酒精擦洗腹膜壁后，用注射器吸10ml 无菌PBS液注入腹腔中，同时从两侧用手指揉压腹膜壁，令液体在腹腔内充分流动。

3）用针头轻轻挑起腹壁，使动物体微倾向一侧，使腹腔中液体集于针头下吸取入针管内。

4）小心拔出针头，把液体注入离心管中，1000r/min 4℃离心10分钟，弃去上清液，重复两次，加入完全培养液重悬。

5）台盼蓝拒染法计数，将细胞稀释到目的浓度后，接种即可。

6） 如果是作为饲养细胞使用，调整浓度至2×105个/mL，接种到96孔板中，每孔100-200 μL；如果作为其它实验使用，可以调整成2×106/mL，加到24孔平底培养板中，1 mL/孔；5% CO2温箱孵育2 h后，换液，并用RPMI1640培养基洗1-2次，弃去未粘附细胞，贴壁细胞为单层的巨噬细胞。

5. 细胞形态（100X）

6. 结果

巨噬细胞刚贴壁时偏圆形，或者类似鹅卵石形状，然后慢慢伸出伪足，铺开呈三角形或多角形。巨噬细胞有吞噬的特性，当与细菌混合在一起的时候，在40倍物镜下可以看到巨噬细胞吞噬细菌，因此，巨噬细胞作为饲养细胞可以清除部分污染的细菌、支原体和部分细胞碎片。

7. 注意事项

1）巨噬细胞是终末分化细胞，不会增殖。

2）很难消化下来，所以接种的时候，必须直接接种到目的培养器皿中。

3）严格无菌操作，在超净台内进行。

4）为避免交叉感染，每一只小鼠更换注射器。

5） PBS切勿注射入内脏，会使腹腔液中红细胞增多，同时可能污染；注射后，要多揉一下再取液；

6）吸取细胞悬液的时候，尽量不要吸到大小肠，否则容易引起成纤维细胞污染。