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1. CRISPR/cas9系统

CRISPR/Cas9 系统由 sgRNA(crRNA 和 tracrRNA 的嵌合体)和 Cas9 组成。crRNA 是一个靶向序列,而 tracrRNA 作为 Cas9 核酸酶募集序列发挥作用。Cas9 具有切割靶 DNA 的核酸酶活性,并通过 RuvC1 和 HNH 结构域切开每条 DNA 链来诱导 DNA 双链断裂(图1)。

图1 CRISPR/cas9系统

2. CRISPR/dcas9系统

大家熟悉了CRISPR-Cas9系统在基因编辑中的革命性作用。Cas9是一种能够定向到特定DNA序列并进行切割的核酸酶。而其变体dCas9(dead Cas9),则是失去了切割DNA功能的Cas9,即对RuvC1 和 HNH 结构域进行突变。由于dCas9的核酸酶活性被剔除,它可以精准地结合到目标DNA序列,而不引起双链断裂,为我们提供了一种新的基因表达调控手段(图2)。

图2 CRISPR/dcas9系统

3. CRISPRi技术介绍

CRISPRi(CRISPR干扰)利用dCas9通过与sgRNA的指导,精确结合到目标基因的启动子区域或编码序列,阻碍转录因子的绑定和RNA聚合酶的功能,从而抑制基因的转录。研究人员可以通过CRISPRi技术来降低特定基因的表达,而不必修改其DNA序列(图3)。

4. CRISPRa技术介绍

CRISPRa(CRISPR激活)则是通过将转录激活因子(例如VP64)融合到dCas9上,并使用sgRNA指导这个复合体到目标基因启动子区域,增强该基因的转录活性。CRISPRa为特定基因的过表达提供了一个有力的工具,尤其适合于研究基因功能和疾病机理(图3)。

图3 dCas9介导的基因调控系统

5. CRISPRa与传统基因过表达的优缺点

与传统的基因过表达方法相比,CRISPRa提供了更高的特异性和更细致的调控。传统方法通过构建包含目标基因的质粒,然后将其导入细胞过表达基因,但这往往难以模拟生理条件下的基因表达模式。CRISPRa则可以在基因的自然位点上调控表达,避免了非生理水平的表达。然而,CRISPRa的脱靶效应和不完全的激活效率仍然是技术上的挑战。此外,就我理解而言,CRISPRa是转录水平的激活,而无法影响可变剪切过程,因此无法精确到单一转录本,而往往我们研究一个基因的时候专注的是其中一条转录本。

CRISPRi与传统基因敲低的优缺点

相比于RNAi等传统的基因敲低方法,CRISPRi具有更高的特异性,因为RNAi可能存在脱靶效应,影响到非目标基因的表达。CRISPRi通过dCas9-sgRNA复合体的特异性结合,降低了这种风险。同时,CRISPRi可以通过调节dCas9-sgRNA复合体的浓度和结合时间来精细调控基因表达水平,这在RNAi中很难实现。尽管如此,CRISPRi技术在某些细胞类型中可能存在转染效率低等问题。

如果目的是研究基因失活对细胞或生物体的长期影响,传统敲除可能更合适;如果目的是研究基因表达的调控和动态变化,CRISPRi可能是更好的选择。

5. CRISPRi/a在CRISPR screen和Perturb-Seq中的应用

CRISPRi/a技术的出现,极大地推进了功能基因组学的研究。通过组合CRISPRi/a和高通量测序技术,研究者可以在全基因组层面进行CRISPR screen(图4),以鉴定影响特定生物学过程的关键基因。Perturb-Seq则结合了CRISPRi/a和单细胞RNA测序,允许科学家在单细胞水平上研究基因干扰或激活的影响,这为揭示复杂生物学系统提供了强大的工具。妥妥的王炸组合,高花费高回报,感兴趣的自己查看相关文章吧。

图4 CRISPR screening流程

总结来说,CRISPRi和CRISPRa技术为分子生物学领域带来了新的革命性工具,它们在基因功能研究和疾病治疗中拥有巨大潜力。但同时,我们也要意识到这些技术仍处于不断发展和优化的阶段,它们的应用也需要结合实验的具体情况和目的谨慎考虑。对于科研而言,理解并掌握这些技术,将为你们的科研工作打下坚实的基础。

参考文献:

Lau, CH., Suh, Y. In vivo epigenome editing and transcriptional modulation using CRISPR technology. Transgenic Res 27, 489–509 (2018).

Gilbert LA, Larson MH, Morsut L, et al. CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Cell. 2013;154(2):442-451.

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