1. CRISPR/cas9系统
CRISPR/Cas9 系统由 sgRNA（crRNA 和 tracrRNA 的嵌合体）和 Cas9 组成。crRNA 是一个靶向序列，而 tracrRNA 作为 Cas9 核酸酶募集序列发挥作用。Cas9 具有切割靶 DNA 的核酸酶活性，并通过 RuvC1 和 HNH 结构域切开每条 DNA 链来诱导 DNA 双链断裂（图1）。
2. CRISPR/dcas9系统
大家熟悉了CRISPR-Cas9系统在基因编辑中的革命性作用。Cas9是一种能够定向到特定DNA序列并进行切割的核酸酶。而其变体dCas9（dead Cas9），则是失去了切割DNA功能的Cas9，即对RuvC1 和 HNH 结构域进行突变。由于dCas9的核酸酶活性被剔除，它可以精准地结合到目标DNA序列，而不引起双链断裂，为我们提供了一种新的基因表达调控手段（图2）。
3. CRISPRi技术介绍
CRISPRi（CRISPR干扰）利用dCas9通过与sgRNA的指导，精确结合到目标基因的启动子区域或编码序列，阻碍转录因子的绑定和RNA聚合酶的功能，从而抑制基因的转录。研究人员可以通过CRISPRi技术来降低特定基因的表达，而不必修改其DNA序列（图3）。
4. CRISPRa技术介绍
CRISPRa（CRISPR激活）则是通过将转录激活因子（例如VP64）融合到dCas9上，并使用sgRNA指导这个复合体到目标基因启动子区域，增强该基因的转录活性。CRISPRa为特定基因的过表达提供了一个有力的工具，尤其适合于研究基因功能和疾病机理（图3）。
5. CRISPRa与传统基因过表达的优缺点
与传统的基因过表达方法相比，CRISPRa提供了更高的特异性和更细致的调控。传统方法通过构建包含目标基因的质粒，然后将其导入细胞过表达基因，但这往往难以模拟生理条件下的基因表达模式。CRISPRa则可以在基因的自然位点上调控表达，避免了非生理水平的表达。然而，CRISPRa的脱靶效应和不完全的激活效率仍然是技术上的挑战。此外，就我理解而言，CRISPRa是转录水平的激活，而无法影响可变剪切过程，因此无法精确到单一转录本，而往往我们研究一个基因的时候专注的是其中一条转录本。
CRISPRi与传统基因敲低的优缺点
相比于RNAi等传统的基因敲低方法，CRISPRi具有更高的特异性，因为RNAi可能存在脱靶效应，影响到非目标基因的表达。CRISPRi通过dCas9-sgRNA复合体的特异性结合，降低了这种风险。同时，CRISPRi可以通过调节dCas9-sgRNA复合体的浓度和结合时间来精细调控基因表达水平，这在RNAi中很难实现。尽管如此，CRISPRi技术在某些细胞类型中可能存在转染效率低等问题。
如果目的是研究基因失活对细胞或生物体的长期影响，传统敲除可能更合适；如果目的是研究基因表达的调控和动态变化，CRISPRi可能是更好的选择。
5. CRISPRi/a在CRISPR screen和Perturb-Seq中的应用
CRISPRi/a技术的出现，极大地推进了功能基因组学的研究。通过组合CRISPRi/a和高通量测序技术，研究者可以在全基因组层面进行CRISPR screen（图4），以鉴定影响特定生物学过程的关键基因。Perturb-Seq则结合了CRISPRi/a和单细胞RNA测序，允许科学家在单细胞水平上研究基因干扰或激活的影响，这为揭示复杂生物学系统提供了强大的工具。妥妥的王炸组合，高花费高回报，感兴趣的自己查看相关文章吧。
图4 CRISPR screening流程
总结来说，CRISPRi和CRISPRa技术为分子生物学领域带来了新的革命性工具，它们在基因功能研究和疾病治疗中拥有巨大潜力。但同时，我们也要意识到这些技术仍处于不断发展和优化的阶段，它们的应用也需要结合实验的具体情况和目的谨慎考虑。对于科研而言，理解并掌握这些技术，将为你们的科研工作打下坚实的基础。
参考文献：