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第一部分:设计shRNA序列

首先打开网站:http://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/setOption.do?designOption=shrna&pid=-9122351712654529539,在Target Design Options处选中shRNA,以Fli1为例,输入Accession number或Nucleotide sequence,其他条件不变:

下拉到底点击RNAi Design,然后出现推荐的10条靶点序列:

https://www.novopro.cn/images/201605241034-6.jpg

根据Rank评星,选择其中需要的(进哥哥一般选择4条,不同位置各一条),点击Design shRNA Oligos:

https://www.novopro.cn/images/201605241034-7.jpg

然后在Default Loop Sequence选择合适的序列(进哥哥用的载体是pGreenPuro,不需要这个序列,就默认了,后面合成引物的时候要去掉的),在Custom Loop Sequence处输入CTCGAG,点击Design:

https://www.novopro.cn/images/201605241034-8.jpg

得到shRNA

需要特别提醒,如果要构建到慢病毒载体上,合成出去的shRNA引物会根据载体有些不一样,sigma用的是pLKO.1载体,小编常用SBI的pGreenPuro(CMV) 载体,两端的酶切位点是BamHI/EcoRI,设计出去的引物最终是这样的(不同shRNA替换中间红色部分):

Sense:GATCCCCCTTCTGACATCTCCTACATCTCGAGATGTAGGAGATGTCAGAAGGGTTTTTG

Anti-sense: AATTCAAAAACCCTTCTGACATCTCCTACATCTCGAGATGTAGGAGATGTCAGAAGGGG

还可以使用GPP这个工具设计:

第二部分:慢病毒载体构建(以pGreen-Puro

步骤1 :退火寡核苷酸链

根据我们的经验,脱盐纯化的寡核苷酸足以满足连接和克隆需要。但是不同供应商提供的引物纯度差别很大,如果您连接和克隆遇到困难,可以考虑换用PAGE纯化或HPLC纯化的引物,或者使用其他供应商提供的引物。

用水将寡核苷酸稀释为100μM。按以下体系配制退火反应体系:

l  正义寡核苷酸(100μM)2μl

l  反义寡核苷酸(100μM)2μl

l  10X T4 DNA连接酶缓冲液 1μl

l  加水15μl补足20μl

退火寡核苷酸链

PCR仪或沸水烧杯中95°C孵育4分钟。如果使用PCR仪,将样品在70°C孵育10分钟,然后在数小时内缓慢冷却至室温。如果使用烧杯水,请将烧杯从火焰中取出,并让水冷却至室温。这将需要几个小时,但对于寡核苷酸退火冷却发生缓慢是很重要的。
步骤2 :酶切载体

用EcoR I和BamH I双酶切2μg载体。酶切方法和体系参照您购买的内切酶说明书或者按照您的实验室习惯的方法进行。

对线性化的载体进行去磷酸化处理是没有必要的。充分酶切后的载体具有不匹配的末端,一般不会发生载体自连。

步骤3 :连接载体

用水将退火后寡核苷酸稀释100倍备用。按照以下体系配制连接反应体系:

l  T4 DNA 连接酶 5U

l  线性化载体    2μl

l  稀释后寡核苷酸 2μl

l  10×连接酶Buffer 1μl

l  加水补足 10μl

接连反应条件和时间参照您购买的连接酶说明书进行。

为了减少空载体自连,连接反应完成后,在连接反应体系中加入1μl BglII,37℃反应30min,切割连接上的空载体。(选做)

步骤4 :转化大肠杆菌感受态

用连接后产物转化大肠杆菌感受态细胞。市场上常见的大肠杆菌感受态细胞(例如Top10,DH5α)均可以使用,您也可以按照分子克隆中的方法自己制备感受态细胞。转化方法按照供应商的说明书或者您实验室中常用的方法进行。

在氨苄抗性的琼脂平板上37℃培养转化后细菌,大约14-16小时后,平板上出现单个细菌菌落。挑取多个菌落至氨苄抗性的培养基中培养后进行鉴定。

步骤5 :转染细胞

pRI系列载体可用常用的转染方法进行细胞转染。包括:磷酸钙转染、脂质体转染、电穿孔转染等。您可以购买市售的商品化转染试剂并且参照供应商说明书进行细胞转染实验。

步骤6 :观测GFP 荧光和稳定表达细胞系筛选

如果细胞转染成功,并且您使用了带GFP的载体,根据细胞生长速度的不同,在转染后3-5天能在荧光显微镜下观察到细胞发出绿色荧光。请注意,绿色荧光蛋白的表达表明转染细胞成功,不能说明RNA干扰实验成功。

如果您使用了带有真核抗性标签如Neo-R的载体,这时您可以加入合适浓度的相应药物如G418进行稳定表达细胞株的筛选。

步骤7 :检测RNA 干扰效率

您可以在蛋白水平或mRNA水平检测RNA干扰效率。一般情况下蛋白的表达变化与mRNA水平的表达变化一致, 也有少数情况下mRNA表达水平变化不及蛋白表达下降明显。

为检测蛋白表达情况,您可以使用Western-Blot。

为检测mRNA表达情况,您可以使用逆转录+Real-time PCR或Northern-Blot。

具体检测方法请参照分子克隆使用指南或者您实验室的常用实验方法。

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