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导读
肺癌是中国乃至全球最恶性的肿瘤,在各类肿瘤中的发病率及死亡率一直位居第一,成为威胁人类健康的头号杀手。同时,肺癌也是临床研究的重要领域,每年与肺癌相关的SCI论文超过万篇,其中肺癌动物模型已逐渐成为其机制研究及药物研发必不可少的工具。本期有幸邀请到了有多年经验的博士师兄,为大家介绍在研究中经常用到的几种肺癌动物模型。

肺癌发病率和死亡率

2017年2月4日,国家癌症中心公布的最新数字显示,在中国恶性肿瘤发病率为270.59/10万,死亡率为163.83/10万,其中肺癌为发病率、死亡率双率第一,每年约59.1万人死于肺癌,其中男性居多,约40.2万。

同样在美国,2017年1月5日,美国癌症协会的统计表明,如下表所示,在美国男性和女性中肺癌的致死率依然是位居第一[1]

图1. 美国癌症发病率和死亡率

肺癌细胞的分类

根据肺癌的分化程度和形态特征,目前肺癌主要分为两大类,即非小细胞肺癌和小细胞肺癌,前者主要包括腺癌、鳞状细胞癌、大细胞癌[2]

 

常见的肺癌模型

肺癌模型主要分为CDTX肺癌细胞移植模型(皮下移植模型和原位移植模型),PDTX(人源肿瘤组织异种移植模型)和基因修饰的肺癌模型,下面依次介绍。

一、CDTX肺癌细胞移植模型

肺癌模型中,根据接种部位主要分为皮下和原位移植模型,在这类模型中需要选择正确的肺癌细胞株,可以参考上表中肺癌细胞分类,并根据实验目的选择正确的荷瘤模型,如皮下荷瘤主要用于单独研究肿瘤生长情况。

1. 皮下荷瘤

定义根据研究的肺癌类型及基因突变情况,选取状态好的肿瘤细胞移植于小鼠皮下。例如,我们研究KRAS突变的肺癌,通常选取KRAS突变的A549细胞,细胞量为1×106-3×106/只。

2. 原位荷瘤

定义将肿瘤细胞通过注射等方式移植到模式动物肺部构建的动物模型。

模型优点与皮下荷瘤模型相比,能更好反映肿瘤在人体内的一个发生发展及转移过程。

实验操作方法:

  1. 细胞系选择及准备工作

    为了便于观察肺癌细胞在体内生长情况,选用带荧光素酶(Luciferase)标签的A549细胞,取对数生长期的A549-Luc(106/只)用胰酶消化收集,1×PBS洗两次,用PBS重悬后与生长因子减少的Matrigel基质胶按1:1的比例混合,每只老鼠注射100µl含1×106个细胞的混合悬液;

  2. 小鼠的准备工作

    选取6-8周龄的Balb/c无胸腺裸鼠,置于超净工作台中麻醉,裸鼠由兴奋状态转为麻醉状态后将其以右侧卧位固定,胸腔表面用酒精消毒。

  3. 切口位置的选取,确定肺部位置

    确定位置位于小鼠左侧肋弓下缘以上约1cm处(第四、五肋弓之间),这一部位有两条纵向较粗的血管,肺部位于这两条血管之间(视频中用黑色marker笔标注位置);

    露出肺部先将表皮剪一约5mm的小口,沿此小口逐步剪开下层皮下及肌肉组织,隔着胸膜可以看到粉色的肺部,肺部会随着小鼠的呼吸收缩和扩张。

  4. 肿瘤细胞注射

    取混匀的100µl的细胞悬液,沿着切口对准小鼠的左肺缓慢注射,进针深度约为3mm,注射结束后停针5s,左右旋转慢速出针。

  5. 小鼠伤口缝合

    将剪开的小鼠表皮进行缝合,将小鼠以右侧卧位(使伤口朝上)置于37℃恒温加热板上直至小鼠苏醒,放回原笼中继续饲养,4-6天伤口即可愈合。

视频:

 

注意事项:

1. 为什么使用Matrigel?

如果肿瘤细胞仅用PBS重悬便注射到小鼠肺部,细胞可能随肺部气管快速扩散,造成气管堵塞导致小鼠死亡,使用Matrigel与细胞混合后进行实验便可降低小鼠死亡风险。

2. 如何避免出血?

操作过程中要避开较粗的血管,以免流血影响后续实验操作以及肺部的观察;并且最好选用胰岛素注射器,由于注射器针头扎入肺部有可能损伤肺部大血管,很容易造成小鼠的死亡,因此注射器最好选用针头较细的胰岛素注射器。

3. 注意整个操作过程及手术器械要保持无菌,以免小鼠感染[3]

后续分组和试验分析

分组时间:一般原位注射一周后,裸鼠肺癌原位模型建成,进行分组(n=10);

如何分组:依据裸鼠体重腹腔注射相应剂量的D-luciferin (Xenogen) 荧光底物(150 mg/kg),将裸鼠放置于麻醉箱中通以2.5%异氟烷/氧,待裸鼠麻醉后转入IVIS厢室中,使其腹面朝下并持续通以麻醉气体,注射底物10min后,进行荧光成像,测量各裸鼠肺部初始荧光值,依据荧光值的大小平均分组。随后可进行给药等实验,定期进行荧光检测。

人道终点:动物伦理学规定,小鼠肿瘤重量不可超过小鼠体重10%,平均肿瘤直径不超过20mm,并且如果出现溃烂,并且严重转移,造成感染或坏死时,应该中止实验且对动物施行安乐死。

图2. 肺部原位注射的荧光图和肺部白光图[4]

二、PDTX(人源肿瘤组织异种移植模型)

定义:将病人肺癌组织移植到小鼠皮下等部位,主要用于抑制肿瘤生长(细胞增殖)的药物的筛选检测,在近年该模型越来越受重视。

模型优点:因为取自病人的肿瘤组织,在组织形态和遗传特征等方面均与人类肿瘤相同,故这种模型可以更贴近人类肿瘤的生物学特性。

实验操作方法:

1)处理新鲜肺癌组织:在无菌条件下的冰上对新鲜离体的肺癌肿瘤组织,剔除包膜及坏死组织,切成约15mm3(2mm×2mm×3mm)的小块;

2)首次接种小鼠:将切好的组织碎片用镊子填入定制的套管针尖端内,注射到5-6周NOD/SCID重症联合免疫缺陷小鼠背部皮下,每只老鼠背部可以接种1-2个位点,每例肿瘤接种2-3只小鼠,此接种过程须在肿瘤标本离体后2h之内完成,为提高成瘤率肿瘤块也可混合10% Matrigel进行荷瘤;

3)再次传代:当裸鼠皮下肿瘤生长至1000 mm3左右,表示移植成功,对其处于对数增长期的原代(F1代)皮下移植小鼠模型进行传代。

  1. 剥离皮下肿瘤,部分组织速冻至液氮备用或经4%多聚甲醛固定后石蜡包埋;

  2. 另一部分组织按照上述接种步骤,移植到4-5只裸鼠皮下,建立第二代移植小鼠模型(F2代);

  3. 按照此流程,在裸鼠体内连续传代3代后,移植瘤的生长速度开始稳定,可进行体内动物模型实验。

后续试验分析:

待皮下肿瘤组织长到一定体积,进行分组(n=10),保证最终可获得6个以上有效数据。

不同处理组的肺癌的PDTX模型[4]

三、基因修饰模型

定义:主要是利用基因编辑技术如CRISPR/Cas9进行敲除或插入特定基因,从而诱发动物产生肿瘤的模型。肺癌基因修饰模型主要是KRAS突变诱导肺癌等产生,KRAS突变同时P53缺失会加速肿瘤的发生发展。

模型优点:主要用于肿瘤发生发展过程及作用机制的研究;同时原癌基因的频发突变是肿瘤产生的重要原因之一,因此靶向这部分原癌基因的抗肿瘤药物筛选是一个重要方向。

构建方法:可以参考我们往期基因编辑小鼠构建过程(包括KO,KI,CKO小鼠的构建等)

举例:Lox-STOP-Lox-KrasG12D Conditional Mouse Model

Ras在人类肿瘤频发突变,K-ras的激活突变是肺部肿瘤产生的原因之一。在k-ras locus上敲入了Lox-Stop-Lox-KrasG12D,通过小鼠鼻腔注入Ad-Cre重组腺病毒,诱导肺中的K-rasG12D表达,从而诱发肺癌[5]

应用:由于其产生的机制及组织形态和遗传特征等方面均与人类K-ras突变肿瘤相似,因此该模型能够很好的评价针对K-ras突变的抗肿瘤药物活性[4]

准确的肺癌动物模型至关重要,它是获得正确实验数据和发表文章的重要前提,本期我们根据多年的经验,为大家总结了3种常见的肺癌模型。随后,我们会继续介绍其他肿瘤模型的构建,所以做其他肿瘤方向的童鞋不要着急,后期内容会越来越精彩。如果您觉得我们的内容还不错,快快点击上方蓝字关注吧!

参考文献

 

[1]Siegel RL, Miller KD, Jemal A. Cancer Statistics, 2017. CA Cancer J Clin. 2017 Jan;67(1):7-30.

[2]Lung Carcinoma: Tumors of the Lungs. Merck Manual Professional Edition, Online edition. [2007-08-15].

[3]Wang YW, Wang XW, Wei JM, et al. Establishment of NSCLC in situ metas- tasis model using GFP/A549 cells. J Shandong Univer (Health Sciences), 2006, 44(7): 698-702. 

[4]Wang J, Hu K, Guo J, et al. Suppression of KRas-mutant cancer through the combined inhibition of KRAS with PLK1 and ROCK[J]. Nature Communications,2016: 11363-11363.

[5]Michel DuPage, Alison L Dooley & Tyler Jack. Conditional mouse lung cancer models using adenoviral or lentiviral delivery of Cre recombinase .Nat Protoc. 2009;4(7):1064-72.

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