想验证miRNA与靶基因的作用？ –双萤光素酶报告基因检测
想了解miRNA和lncRNA/circRNA的靶向互作？–双萤光素酶报告基因检测
想知道转录因子对下游基因的作用？ –双萤光素酶报告基因检测
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Dual-Luciferase®双萤光素酶报告基因检测系统：在细胞中同时表达萤火虫萤光素酶(Firefly Luciferase简称F-Luc)和海肾萤光素酶(Renilla Luciferase简称R-Luc)，其中F-Luc作为报告基因反应目的基因表达的改变，R-Luc作为内参基因，为实验提供统一基准线（减少内在变化因素如培养细胞的数目，细胞转染和裂解的效率对实验准确性的影响）。所构成的报告系统广泛用于基因调控、非编码RNA靶向互作等研究领域。
F-Luc表达框的上游启动子区域插入不同功能序列，通过转录起始条件改变造成其报告萤光的变化。F-Luc的3’UTR区域替换成靶基因的3’UTR，过表达microRNA（降解mRNA或者翻译抑制），可以反映是否存在靶向互作。
miRNA靶基因验证
实验原理
miRNA主要通过作用于靶基因的3’UTR起作用（降解或抑制翻译），将目的基因3’UTR（野生型和结合位点突变型）序列构建至载体中报告基因F-Luc的3’端，通过比较过表达miRNA后，报告基因表达的改变（萤光素酶的活性下降还是不变），来确定miRNA与靶基因3’UTR的作用位点。
案列介绍
题目: Tumor-derived exosomal miR-1247-3p induces cancer-associated fibroblast activation to foster lung metastasis of liver cancer
期刊: Nature Communications
小结：验证B4GALT3（β-1,4-半乳糖基转移酶III）基因具有miR-1247-3p的靶向结合位点。将B4GALT3预测结合位点的序列克隆到报告基因载体，同时构建靶位点突变的载体，分别共转miR-1247-3p mimics及NC mimics，结果显示转染miR-1247-3p 的WT组相对荧光值降低，MUT组不变，提示存在靶向结合。
Tian Fang et al.,Nature communications，2018
相关实验：miRNA同lncRNA/circRNA靶向互作
启动子活性验证
实验原理
转录因子主要通过作用于靶基因的启动子起作用，将目的基因启动子区序列替换报告基因F-Luc的启动子，通过共表达转录因子后，报告基因表达的改变，来确定转录因子与靶基因启动子结合位点及对靶基因的作用。
案列介绍
题目：Invasion of white matter tracts by glioma stem cells is regulated by a NOTCH1-SOX2 positive-feedback loop
期刊：Nature Neuroscience
小结：验证Sox9在Sox2启动子区有多个结合位点，构建不同的启动子片段到报告基因载体中，共表达Sox9，显示插入片段的缩短和推测结合位点的减少，荧光素酶活性也随之下调。
Jun Wang et al.,Nature neuroscience,2018
根据实验目的设计实验方案—预测结合位点–构建野生/突变报告基因载体系统—共转染细胞—检测酶活
常用靶基因结合位点预测网址：
http://genie.weizmann.ac.il/pubs/mir07/mir07_dyn_data.html
常用转录因子结合位点预测网址：
实验步骤
主要分为：质粒构建→质粒转染细胞→双报告基因检测→统计学分析。
质粒转染细胞：
2、转染：16小时后转染萤光素酶报告基因质粒和RNA，每个样品设置6个复孔。
1) 配制DNA和转染试剂: 96孔板转染质粒时每孔比例Firefly：Renilla：转染试剂=0.1μg：0.01μg：0.25μl；
2) 配制RNA和转染试剂稀释液，RNA的终浓度为100nM，转染试 剂每孔0.25μL；
3) 稀释好的DNA和RNA及转染试剂，常温孵育5min；
4) 将稀释好的DNA和RNA分别和转染试剂混匀，常温孵育20min；
5) 每孔弃去50ul培养基，将25μL DNA转染混合液和25uL RNA转 染混合液分别添加到每孔细胞样品中；
6) 转染6小时后，换新鲜完全培养基。
双报告基因检测：
2、 倾斜96孔板，吸干剩余的PBS；
3、去离子水将5XPLB稀释成1XPLB，使用前放到常温；
4、每孔加50μl稀释好的 1X PLB，摇床常温条件下摇15min，进行裂 解；
5、白色不透光的96孔酶标板中每孔加步骤4的上清液10μl， 加入100 μl预先混好的LAR II，2s后测数据；
6、每孔添加100μl预先混好的Stop&Glo Reagent，静止2s后，测数 据 注意：进行Luciferase活性检测时，需在避光条件下进行。
（1）验证miRNA同mRNA靶向互作。将靶mRNA的3’UTR序列插入报告基因载体，再共转入该miRNA，如果萤光素酶活性下降，则提示为其靶序列。
（2） 验证miRNA同circRNA靶向互作。将circRNA序列插入报告基因载体中F-Luc的3’UTR区域，检测萤光素酶活性。
（3） 验证miRNA同lncRNA靶向互作。将lncRNA序列插入报告基因载体中F-Luc的3’UTR区域，检测萤光素酶活性。
（4）启动子活性分析。将启动子区域序列进行分段截短，再分别构建入报告基因载体，检测其启动子活性。
（5） 验证特定转录因子同启动子的作用。将启动子区域插入报告基因载体，同时在实验细胞中共转该转录因子，分析转录因子过表达是否提高萤光素酶活性。
（6）分析信号通路是否激活。将该信号通路的下游响应原件序列构建入报告基因载体，在不同上游信号条件下，萤光素酶活性代表了通路的下游响应。