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FlowJo 是美国斯坦福大学 Leonard Herzenberg 实验室研发的一款流式数据分析软件,它可以对所有流式细胞仪产生的数据进行分析,在多种电脑操作系统上兼容性良好。

由于功能强大,简单易用,已经被生命科学领域内的科学家、实验室广泛使用;同时 FlowJo 也是各高影响力核心期刊最受欢迎的流式数据分析软件。


Flowjo 破解版链接:
链接:https://pan.baidu.com/s/1LFfPwoadOAQF1HrDpDAhhw
提取码:37kz

安装说明:

1. 安装Flowjo-win64-10.3.0。
2. 管理员权限运行b-fj103x64.exe,指定flowjo的安装位置,打上破解补丁。
3. 取一U盘,大小不限,将license.key放入U盘根目录。
4. 运行flowjo,点击右下角license按钮,选择Use a hardware-based license(dongle)并点击OK。
5. 等待片刻,界面上的Unlicensed copy变为Drag samples here,即破解完成。以后运行时必须将此U盘插上。



本文主要针对流式分析中常用的平均荧光强度 (MFI),五个小步骤带你快速分析出 MFI。

01

打开 FloJo,显示工作台。

02

找到原始数据(fcs 格式文件)

Ctrl+A 将所有文件全选,鼠标将其直接拖到 All Samples 中,如图:

03

针对数据一进行分析

1、鼠标左键点击 fcs 格式数据出现流式散点图,X 轴默认选择 SSC(侧向散射,其散射强度与细胞内颗粒结构的质量正相关,即细胞内颗粒结构越复杂,质量越大,SSC 越大;反之越小)。

Y 轴默认选择 FSC(前向散射,该值与细胞的直径正相关,即细胞越大,FSC 越大;反之越小)。

2、圈门:根据实验目的选择合适的圈门工具(矩形门、十字门、椭圆门、多边形门)进行圈门,圈出需要进行分析的细胞后点 OK 确认。圈出的细胞默认为 Lymphocytes(当然也可以根据自己的需要重命名),下方的比例代表这群细胞占总细胞的百分比。

3、对圈出细胞进行分析,双击 Lymphocytes 选中这群细胞,根据实验目的、染料所需的荧光激发 / 发射波长选择合适的横纵坐标,完成后关闭处理界面回到软件主界面。

我选取的横坐标是 PE-A,纵坐标是 Histogram,点击横坐标边上的 T 可将横坐标数值改为 log 值,将其变为正值,得到下图。

4、添加 MFI:选择横坐标下方的Σ Statistion,点击下面的Σ+ 打开新界面,单击左边框的 Mean,选择想要分析的 PE-A,点击 Add 添加可以使其 MFI 在Σ Statistion 框中显示。

04

对其他数据进行批处理中

鼠标拖拽已处理文件到 All Samples 中,即可实现对其他数据的批量处理,简单高效。

05

数据导出

点 File 下方的 Save As 可导出到 Excel 表格,通过筛选等命令对数据快速处理,十分方便。

以上是本人对流式分析中常用到的 MFI 处理所了解的基本操作,希望对大家有所帮助。

26 Replies to “FlowJo流式分析教程:手把手教你分析出平均荧光强度”

  1. 您好,最近开始做细胞BODIPY的流式,有点摸不着头脑,不懂得怎么对数据进行分析,是不是也是按照您这个步骤进行呢?

    1. 你好,这个使用仪器原始数据进行分析的教程,对于你的数据,仪器对应的软件在上机时会给出平均荧光强度的值,你只要拿他进行统计分析即可

  2. 您好,请问在绘制出Histogram-PE图之后,图的横纵坐标的数值各是什么意思是啊

    1. 根据你的需求来的 纵坐标histogram是指的直方图,选择通道的话显示的就是散点图 两种呈现方式 直方图是一维的 散点图是二维的

      1. 一般来说不行,尤其是同一个受试者不同时间点采的样还有汇报平均荧光强度相关的实验,需要在同一个实验参数下进行;有时候可能存在明显的个体差异时,有些受试者分群明显差异,可以调整圈门,但是电压补偿值一般不建议随意调整,有操作数据之嫌

  3. 王老师,如果导出的平均荧光为负值,是弃掉数值吗还是就用负值统计分析呢

    1. 首先你得明白负值出现的原因,如果整个峰图位于原点附近,下次试验需要调高电压 让荧光强度增强,结果更加明显;如果峰图是在原点右侧,此时如果还是负值,可能有一些比较低的信号干扰,把主峰圈出来分析
      不明白加我微信讨论

      1. 在同一个电压和补偿参数同一个时间段同一只鼠同为CD8的marker, 它的脾组织主峰图在右侧,但是骨髓的在左侧,是负值,这也是低信号干扰吗

        1. 我不确定你使用同一个电压补偿做脾和骨髓的目的,一般情况对于不同细胞需要分别建立模板,即分别设置电压补偿,因为不同细胞本底荧光不一样
          而且一般情况下CD8是输出比例,会有阴阳性峰
          具体问题不是很确定 需要你的原始文件 可以加微信讨论

  4. 你好,请问有无遇到过flowjo的dateset会以fsc3.0的形式打开 ,导致细胞在fc-ss散点图中位于坐标边缘的情况

  5. 同时,还有个疑问想咨询下您。这边统计出来的平均荧光强度直接用相应的数据分析软件如Prism进行分析是嘛?

  6. 你好,这边有一个疑问,您这样圈出来后,相应组中的细胞数量不一样,不会影响实验结果嘛?

    1. 细胞数量不太可能一模一样,没有关系的,这是一个统计上的结果,计算的平均值,保证你所圈出的细胞数量足够多就好

      1. 好的,谢谢。没想到您真的会回复。我按照您这边的Protocol操作了下。但是统计出来的我这边加药组与对照组无差异。这边使用的是GCaMP5来检测细胞内的Ca2+浓度。不知道是不是我圈门存在问题。

        这边可以请教您关于圈门的问题嘛?不知道能不能发送图片给您?

          1. 好,谢谢。刚刚已经发送过去了。

Donghai Tang进行回复 取消回复

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