1、安装后首先打开ImageJ：

2、打开要分析图片：File>open（热键为Ctrl+O）

3、转换成8bit的灰度图：Image>Type>8-bit

4、黑白反转（因为对于光密度（OD）来说越白数值越小，纯白为0；越黑数值越大，纯黑理论上是无限大。因此我们需要将上一步所转换的灰度图进行黑白反转，不然的话测出来的数值就会荧光越亮反而数值越小）：Edit>Invert（热键为Ctrl+Shift+I）

以下为从左到右分别为原图、8bit灰度图及反转后的图：

5、校正光密度（软件默认为测量灰度，因此我们要改为更加适用的光密度，其中原理不是一两句话能说得清的，这里忽略）：Analyze>Calibrate

在弹出来的界面的Function选择Uncalibrated OD，并下界面左下方勾选Global calibration，然后点击右下角的OK

点击OK后会跳出校正后的光密度曲线：

如不勾选Global calibration，光密度的校正只对这张图片有效，一般分析都要分析多张图片，所以需要勾选，勾选后在打开另一图片时会提示是否将此校正应用于所有图片，不勾选Disable Global Calibration，勾选Disable these Messages

6、选择测量单位（一般选择象素，如有明确的比例，也可以选择相应单位）：Analyze>Set scale

点击后在弹出的界面里点击中间的click to Remove Scale，并勾选下面的Global（同样的，如不选Global这个测量单位的选择只对这张图片有效），最后点击OK

7、选择测量项目：Analyze>Set Measurements

在弹出界面中选择我们需要测量的项目Area、Integrated density，并勾选下面的Limit to threshold（这个选项是指只测量我们选中的范围，如不勾选侧会测量整张图片数据），选择后点击OK

8、选择测量域值：Image>Adjust>Threshold（热键为Ctrl+Shift+T）

滑动弹出界面中间的滑块选择适合的域值，以使的你图片中的细胞或待测目标刚好全部被选中，选好之后点击右下角的Set

在弹出来的界面点击OK

9、测量：Analyze>Measure（热键为Ctrl+M或直接按M）

10、记录数据并计算：

结果中的Area为选择范围的面积，如果是测量的是细胞的话就是细胞在图中的面积；IntDen就是所选范围的IOD（光密度的总和）。

结果界面中的数据可以复制到Excel等软件中进行计算。

用IntDen的数值除以Area的数值得出来的就是这张图片中细胞的平均光密度，以这张图片的数据为例，即：18854/179252=0.105181532（/pixel）

同法测量多张图的平均光密度值后就可以进行半定量比较。

以下附上分别应用Image-Pro Plus及ImageJ对五张图片进行分析的结果对比：

从结果的对比看来ImageJ与IPP（Image-Pro Plus）的分析结果是基本一致的