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手把手教你双荧光素酶检测实验! – 王进的个人网站



伴随着春天的脚步,萤光素酶生物传感器技术(Luciferase Biosensor Technology)也迎来了其 30 岁的生日。1990 年技术诞生,1993 年 Promega 第一个萤光素酶(又称荧光素酶专利获批, 到 1996 年 Promega 的 Dual-Luciferase® Reporter Assay System 双萤光素酶报告基因检测系统的推出,为研究者的实验提供了更加可靠的工具,成为萤光素酶技术历史上的里程碑事件,也奠定了 Promega 在此领域中的地位。
 
生物发光技术帮助科学家研究从前在活细胞中无法检测到的活性变化,并成为放射性技术的重要替代方法。之后 Promega 不断在萤光素酶技术拓展推陈出新。1999 年 CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay 产品发布,成为 20 年来最为经典的细胞活力检测工具,也是现在药物研发领域细胞活力检测的金标准。
 
2012 年迎来革新性的萤光素酶 NanoLuc® Luciferase 的诞生,并成为当年 The Scientist 杂志评选的全球十大创新技术,NanoLuc® Luciferase 只有 19 KD,是目前世界上最亮的萤光素酶,其独特的特性加上 Promega 的雄厚研发实力和经验,使萤光素酶技术跨入了更广阔的应用领域。如果历数萤光素酶的前世今生真的是个长长的故事。我们容后再详述,大家可以期待一下哦。
 
要说萤光素酶技术的应用数不胜数,启动子 、增强子、核受体的研究;信号通路、转录后调控、酶活性的研究;细胞健康、能量代谢、蛋白功能、蛋白相互作用……都不能一口气说的完。当然最为经典的当属萤光素酶报告基因技术。此次为了回馈经典萤光素酶报告基因技术的用户,今天萤光素酶报告基因界的一(Xiao)休(Mai)正式上线,你的提问我来答。
 

来,不用休息了,来提问吧~最后请将你想问的问题告诉我们,我们会一一为大家解答。留言方式见文章最后~

Q
为什么要选择双萤光素酶报告基因,双萤光素酶报告基因检测到底有哪些优势呢?萤光素酶报告基因检测数据如何归一化 ?
A
研究者常常使用单萤光素酶报告基因系统来监测遗传调控元件的功能,因为其操作简单而且反应灵敏。但是,单报告基因系统无法区分不同实验组之间信号的变化是来自对报告基因的特异调控,还是细胞整体事件的结果(增殖、凋亡、坏死等),也无法区分不同组之间转染效率和细胞数目差异带来的影响。所以,在分析实验结果之前,一般会通过样品的其他特征先对数据进行校正,尽量减少上述非实验研究变量的干扰,这也就是数据的归一化处理
 
常用的归一化方法有:细胞总蛋白,细胞活力,细胞数,及内参报告基因等。对于稳定转染的单报告基因细胞系来说,细胞总蛋白、细胞活力(例如 CellTiter-Glo® 或 CellTiter-Fluor™ Viability Reagent)、细胞数这几个参考指标,可以很好的排除不同组之间由细胞整体事件和细胞数目带来的干扰。
对于瞬时转染实验,这几个指标只能排除一部分干扰,转染效率可能引入的显著变异,却无法解决。这种情况下,建议共转染另外一个可以组成型表达的报告基因,来作为内对照,即内参报告基因(双报告基因系统)。内参报告基因的活性与转染的 DNA 量与细胞整体的蛋白表达能力相关。用内参基因的表达活性来校正待测基因的表达量,可以排除转染效率和细胞整体事件对结果的影响。

Normalizing Genetic Reporter Assays: Approaches and Considerations For Increasing Consistency And Statistical Significance
By Trista Schagat, Ph.D., Aileen Paguio, M.S., And Kevin Kopish, B.S., Promega Corporation
Q
选择双萤光素酶报告基因时该如何选择海肾内参载体呢?
A

通常选择带有组成型表达启动子的海肾萤光素酶表达载体来作为内参,主要包括 pRL 系列和 pGL4 系列中的部分载体。

理论上,内参载体和主报告载体并非一一对应,例如 pGL3 系列载体,既可以选择用 pRL 系列载体作为内参,也可以选择 pGL4 系列海肾萤光素酶表达载体作为内参。不过,不同时期的载体产品表达效率可能会相差较大,使用同一代产品,两者的表达效率相近,更容易调整两种载体共转染比例,这可能是大部分使用者更常见的选择方案。

同一代的不同海肾内参载体之间,最主要的区别是携带的启动子不同,包括 CMV、SV40、TK 等。通常,内参基因表达的活性应当显著的高于背景组,同时,尽量小,确保不干扰主报告基因的表达。所以,我们建议选择内参载体时,首先考虑活性较弱的 TK 启动子驱动的载体(例如 pRL-TK,pGL4.74)。当通过文献资料或者预实验,发现该载体在目标细胞模型中表达效率过低,或者会受到实验研究因素干扰时,再考虑其他表达活性更强的载体(例如 pRL-SV40 或 pGL4.75),或自己构建所需的特殊启动子载体

Q

pGL3 和 pGL4 系列载体有啥区别?

A

pGL3 系列包含 luc+firefly luciferase gene,pGL4 系列包含优化的编码基因 luc2 firefly luciferase gene,在哺乳动物细胞中表达效率更高;pGL4 系列还包含携带优化的海肾萤光素酶编码基因 hRluc 的载体。

 

 

与 pGL3 载体相比,pGL4 载体骨架结构中与转录因子结合位点一致的序列,也大大减少。本底表达值更低,信噪比更好,被非特异调控的可能性更低。

 

 

pGL4 系列中增加了预构建的信号通路研究载体,带有快速应答功能载体和带有稳定筛选标签的载体,应用更灵活方便。

Q
做 miRNA 靶基因研究,选择哪个载体合适?
A
pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target Expression Vector(E1330是为 miRNA 靶标研究而设计的载体,可通过将 miRNA 的靶序列插入到主报告基因萤火虫萤光素酶基因(luc2)的下游或者 3’端而实现。
萤火虫萤光素酶表达的下降意味着内源性的或外源引入的 miRNA 与克隆的 miRNA 的靶序列发生了结合。这一载体是基于 Promega 的双报告基因技术,萤火虫萤光素酶基因(luc2)作为主报告基因,用于监控 miRNA 的调节,海肾萤光素酶基因(hRluc-neo)作为内参 报告基因,用于进行归一化处理和稳定转染的筛选标记。

 

与 psiCHECK™-2 载体相比有以下特点/优点:pmirGLO 载体主报告基因所带的启动子 PGK 为中等强度的启动子;载体上带有 Neo 抗性基因,可作为稳定转染筛选标记;主报告基因为萤火虫萤光素酶基因,更符合大部分人的使用习惯。
 
psiCHECK™-2 Vector(C8021最初是为验证 siRNA 靶标设计的。该载体用海肾萤光素酶(hRluc)作为主报告基因;萤火虫萤光素酶(hluc+)则作为内参 报告基因,用于进行归一化处理。目的基因被克隆至海肾萤光素酶翻译终止密码子下游的多克隆位点。由合成的 siRNA 或体内表达的 shRNA 引发的针对目的基因的 RNAi 过程,导致融合 mRNA 的剪切和随后的降解。也有文章中用 psiCHECK-2 进行 miRNA 研究。
但与 pmirGLO 载体相比,有以下两个缺憾:1. 酶切位点少;2. SV40 启动子活性高,用于调节效果明显的 siRNA 可行,而当 miRNA 抑制作用比较弱时,不容易观察到明显的变化。由于 miRNA 的调节作用通常是微量调节,使用中等强度启动子驱动报告基因表达的载体(如 pmirGLO 载体)通常更合适一些。
Q
萤火虫萤光素酶检测试剂盒有很多,要如何选择呢?
A
萤火虫萤光素酶检测系统特点及区别如下表所示:
  • 实验通量大时,建议选择信号更稳定、均质型(Homogenous)的检测系统;
  • 样品中萤光素酶含量低时(难转染细胞模型等),建议选择信号强度高的检测系统;
  • 有自动加样设备时,可以用闪光型(Flash)系统进行较多样品的检测,否则辉光型(Glo)系统操作更简便、结果更稳定;
  • 培养的动物细胞适用于所有检测系统,非动物细胞样品首选非均质型检测方法;
  • 非均质型试剂可以在任何规格的孔板培养细胞;均质型试剂推荐在 96/384 孔板中培养细胞,或与 Glo lysis Buffer(Cat#E2661)配合使用,采取非均质方式检测
Q
萤光素酶检测需要使用什么仪器?
A
基于萤光素酶反应原理的检测系统,需要使用发光检测仪(Luminometer),或者带有发光检测模块的多功能微孔板检测仪。不同的仪器灵敏度和信号相互干扰程度,差异较大。(详情请登录 Promega 官网查阅)  
Q
Promega 的新品 NanoLuc® 萤光素酶与经典萤火虫萤光素酶和海肾萤光素酶相比,到底有哪些特点和优势呢?
A
NanoLuc® 萤光素酶是一种新的萤光素酶,来源于深海细角刺虾,是一个 19kDa 的蛋白质。经过对蛋白质结构的优化,和对特异性底物的改造之后,在细胞中表达的 NanoLuc® 萤光素酶与底物 Furimazine 反应,可使哺乳动物细胞的发光活性提高约 250 万倍。
 
NanoLuc® 萤光素酶辉光型检测试剂的信号半衰期大于两小时,而信号强度大约是等量的同类反应条件下萤火虫萤光素酶或海肾萤光素酶的 150 倍。在哺乳动物细胞中,NanoLuc® 萤光素酶未显示翻译后修饰或亚细胞分区的迹象。
 
该酶具有很高的物理稳定性,可以在高达 55 ℃ 的温度下或在 37 的培养基中保温 15 小时以上而保持活性。因为其分子量小,发光强度大,稳定性高,除了作为报告基因用于基因表达调控研究,它还可以用作蛋白质融合表达标签,并开发了一系列新的应用方向,例如蛋白质相互作用研究,蛋白质降解研究(PROTAC),细胞活力和凋亡实时监测等等。
 

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