检测甲基化状态的方法比较多，目前被认为金标准的是亚硫酸盐的测序法（bisulfite sequencing PCR,BSP）。

BSP原理

用亚硫酸氢钠修饰处理基因组DNA，所有未发生甲基化的胞嘧啶（C）被转化为尿嘧啶（U）而甲基化的胞嘧啶则不变。

基因组DNA经亚硫酸盐处理后，设计BSP引物扩增目的片段，此时尿嘧啶（U）全部转化为胸腺嘧啶（T），最后对PCR产物进行测序就可以判断CpG位点是否发生甲基化。

 

BSP实验流程:

DNA抽提和亚硫酸盐处理都可参考相应的试剂盒进行操作

引物设计网站网址如下：http://www.urogene.org/cgi-bin/methprimer2/MethPrimer.cgi

网址引物设计界面如上图，可选择设计什么类型的引物，此处选择设计BSP引物。

该网站可提供CpG岛的预测等功能，所以可选择通过预测CpG岛后用于引物设计的选项，如下图：

其他参数选择默认值即可，仍以人的GAPDH启动子序列为例

设计结果如上，预测到有2个CpG岛，根据测的结果反馈设计的引物如上图

另外可根据自己的需要调整引物设计的相关参数，如下图

另外预测结果中还给出了亚硫酸盐处理前后序列的变化情况、引物对应的位置以及CpG位点的位置情况：

另外在设计引物中还有相关注意事项：

用于BSP实验的DNA是经过亚硫酸盐处理，将未甲基化的C碱基转变为U碱基，而甲基化的C碱基不变，从而将甲基化的差异转变成碱基上的差异，所以在后续进行PCR扩增引物设计的时候需要注意：

1、引物设计不能含有CpG位点，以避免造成发生甲基化和未发生甲基化DNA的差异。

2 、引物扩增的片段能包含尽量多的CpG位点，BSP扩增片段长度300-500bp，包含的CpG位点越多则引物的打分越高。

BSP引物设计完成后应进行PCR扩增直接测序或者通过TA克隆测序分析甲基化频率。

BSP直接测序结果

BSP点状图

空点表示为未发生甲基化的CpG位点，实点表示发生甲基化的CpG位点

BSP柱状图