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检测甲基化状态的方法比较多,目前被认为金标准的是亚硫酸盐的测序法(bisulfite sequencing PCR,BSP)。

BSP原理

用亚硫酸氢钠修饰处理基因组DNA,所有未发生甲基化的胞嘧啶(C)被转化为尿嘧啶(U)而甲基化的胞嘧啶则不变。

基因组DNA经亚硫酸盐处理后,设计BSP引物扩增目的片段,此时尿嘧啶(U)全部转化为胸腺嘧啶(T),最后对PCR产物进行测序就可以判断CpG位点是否发生甲基化。

 

BSP实验流程:

DNA抽提和亚硫酸盐处理都可参考相应的试剂盒进行操作

引物设计网站网址如下:http://www.urogene.org/cgi-bin/methprimer2/MethPrimer.cgi

网址引物设计界面如上图,可选择设计什么类型的引物,此处选择设计BSP引物。

该网站可提供CpG岛的预测等功能,所以可选择通过预测CpG岛后用于引物设计的选项,如下图:

其他参数选择默认值即可,仍以人的GAPDH启动子序列为例

设计结果如上,预测到有2个CpG岛,根据测的结果反馈设计的引物如上图

另外可根据自己的需要调整引物设计的相关参数,如下图

另外预测结果中还给出了亚硫酸盐处理前后序列的变化情况、引物对应的位置以及CpG位点的位置情况:

另外在设计引物中还有相关注意事项:

用于BSP实验的DNA是经过亚硫酸盐处理,将未甲基化的C碱基转变为U碱基,而甲基化的C碱基不变,从而将甲基化的差异转变成碱基上的差异,所以在后续进行PCR扩增引物设计的时候需要注意:

1、引物设计不能含有CpG位点,以避免造成发生甲基化和未发生甲基化DNA的差异。

2 、引物扩增的片段能包含尽量多的CpG位点,BSP扩增片段长度300-500bp,包含的CpG位点越多则引物的打分越高。

BSP引物设计完成后应进行PCR扩增直接测序或者通过TA克隆测序分析甲基化频率。

BSP直接测序结果

BSP点状图

空点表示为未发生甲基化的CpG位点,实点表示发生甲基化的CpG位点

BSP柱状图

3 Replies to “亚硫酸盐的测序法(bisulfite sequencing PCR,BSP)”

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