检测甲基化状态的方法比较多,目前被认为金标准的是亚硫酸盐的测序法(bisulfite sequencing PCR,BSP)。
BSP原理
用亚硫酸氢钠修饰处理基因组DNA,所有未发生甲基化的胞嘧啶(C)被转化为尿嘧啶(U)而甲基化的胞嘧啶则不变。
基因组DNA经亚硫酸盐处理后,设计BSP引物扩增目的片段,此时尿嘧啶(U)全部转化为胸腺嘧啶(T),最后对PCR产物进行测序就可以判断CpG位点是否发生甲基化。
BSP实验流程:
DNA抽提和亚硫酸盐处理都可参考相应的试剂盒进行操作
引物设计网站网址如下:http://www.urogene.org/cgi-bin/methprimer2/MethPrimer.cgi
网址引物设计界面如上图,可选择设计什么类型的引物,此处选择设计BSP引物。
该网站可提供CpG岛的预测等功能,所以可选择通过预测CpG岛后用于引物设计的选项,如下图:
其他参数选择默认值即可,仍以人的GAPDH启动子序列为例
设计结果如上,预测到有2个CpG岛,根据测的结果反馈设计的引物如上图
另外可根据自己的需要调整引物设计的相关参数,如下图
另外预测结果中还给出了亚硫酸盐处理前后序列的变化情况、引物对应的位置以及CpG位点的位置情况:
另外在设计引物中还有相关注意事项:
用于BSP实验的DNA是经过亚硫酸盐处理,将未甲基化的C碱基转变为U碱基,而甲基化的C碱基不变,从而将甲基化的差异转变成碱基上的差异,所以在后续进行PCR扩增引物设计的时候需要注意:
1、引物设计不能含有CpG位点,以避免造成发生甲基化和未发生甲基化DNA的差异。
2 、引物扩增的片段能包含尽量多的CpG位点,BSP扩增片段长度300-500bp,包含的CpG位点越多则引物的打分越高。
BSP引物设计完成后应进行PCR扩增直接测序或者通过TA克隆测序分析甲基化频率。
BSP直接测序结果
BSP点状图
空点表示为未发生甲基化的CpG位点,实点表示发生甲基化的CpG位点
BSP柱状图
重亚硫酸盐转换后的DNA跑胶为什么会没条带?
重亚硫酸盐处理之后DNA会被破坏打断,所以原来基因组的那一条带不会存在 在低分子量位置有弥散条带就是处理之后的
如果进行过了WGBS的话,DMR在该基因的外显子和内含子上,那么这个DMR如何验证呢,DMR在内含子上的话,这个基因是否有关注的必要呢,麻烦老师了
您好,对于确定位点的验证,建议BSP测序验证,比较简单直接;
内含子区可能价值不大,最好还是启动子区的,减少试错可能性,当然时间足够可以同时做做
非常感谢您的答复
麻烦问一下后续的分析图是从那个网站分析的,谢谢。
点状图吗 一个比较老的软件BiQ_Analyzer
很全面!