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一、 线粒体蛋白提取

  1. 线粒体蛋白抽取液配方(pH7.4):
    250mM蔗糖,20mM HEPES,10mM KCl,1.5mM MgCl2,1mM EDTA,1mM EGTA,1mM DTT,17ug/mL PMSF,8ug/mL aprotinin,2ug/mL leupeptin;-20℃保存。
  2. 步骤:
    (1)收集5X10E7细胞,并用 PBS洗细胞;
    (2)往细胞沉淀加入2mL上述抽取液,并混匀,可以采用超声或匀浆器方法破膜,程度至苔盼兰染色约90%的细胞为蓝色。
    (3)750g,4℃离心5分钟,收集上清,此时沉淀即为细胞膜成分。
    (4)13000rpm,4℃离心30分钟, 弃上清,此时沉淀即为线粒体成分。
    (5)用100uL列解液重悬沉淀,-80℃保存备用.

二、 培养悬浮细胞全蛋白裂解的方法

  1. 细胞裂解液(pH8.0)的配方:
    20mM Tris-Cl,1% NP-40, 137mM NaCl, 20mM DTT, 2mM Sodium Vanadate,1ug/mL Aprotinin, 1ug/mL leupetin, 1mM PMSF;配好后分装-20℃保存,其中 PMSF和蛋白酶抑制剂量使用时现加。
  2. 裂解方法:
    (1) 按1X106细胞/100uL的比例加细胞裂解液,混匀后冰浴30分钟;
    (2) 12,000rpm, 4℃,离心10min;
    (3) 实验时取25uL的上清加5uL 6X上样缓冲液煮沸5分钟使蛋白变性后,12000rpm离心5分钟,取上清和预染Marker加样电泳。或-80℃保存备用。

三、 细胞核蛋白质的提取

  1. 试剂准备
缓冲液A缓冲液B
10mmol/L HEPES-KOH pH7.920mmol/L HEPES-KOH pH7.9
1.5mmol/L MgCL21.5mmol/L MgCL2
10mmol/L KCL420mmol/L NaCL
0.5mmol/L DTT0.2mmol/L EDTA
0.2mmol/L PMSF25% Glycerol                                                           
0.5mmol/L DTT
0.2mmol/L PMSF
  • 操作步骤
    (1) 去细胞培养液,用PBS(含0.05mmol/LPMSF)洗两次,用刮板将细胞刮下,计数细胞,收集于适当体积离心管,用少量PBS冲洗平皿一并吸入离心管。
    (2) 4C离心5分钟,使细胞沉淀。
    (3) 弃上清,将沉淀的细胞用含PMSF的PBS悬起再离心,重复两次。洗去全部细胞培养液及血清成分。
    (4) 取5×105-7细胞,4C离心,弃上清。
    (5) 加入400μl冷缓冲液A,手指弹管壁使沉淀悬起,冰浴10分钟,震荡10秒钟,混匀。
    (6) 离心10秒钟,弃上清,加20~100μl冷缓冲液B使沉淀悬起,冰浴20分钟。
    (7) 4C离心2分钟,弃沉淀。
    (8) 上清为核提取物,分装后-70C保存。(此法每1×106细胞可得到50~75μg核蛋白质)。

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