一、 线粒体蛋白提取
- 线粒体蛋白抽取液配方(pH7.4)：
250mM蔗糖，20mM HEPES，10mM KCl，1.5mM MgCl2，1mM EDTA，1mM EGTA，1mM DTT，17ug/mL PMSF，8ug/mL aprotinin，2ug/mL leupeptin；-20℃保存。 - 步骤：
（1）收集5X10E7细胞，并用 PBS洗细胞；
（2）往细胞沉淀加入2mL上述抽取液，并混匀，可以采用超声或匀浆器方法破膜，程度至苔盼兰染色约90%的细胞为蓝色。
（3）750g，4℃离心5分钟，收集上清，此时沉淀即为细胞膜成分。
（4）13000rpm,4℃离心30分钟, 弃上清，此时沉淀即为线粒体成分。
（5）用100uL列解液重悬沉淀，-80℃保存备用.
二、 培养悬浮细胞全蛋白裂解的方法
- 细胞裂解液（pH8.0）的配方：
20mM Tris-Cl，1% NP-40, 137mM NaCl, 20mM DTT, 2mM Sodium Vanadate，1ug/mL Aprotinin, 1ug/mL leupetin, 1mM PMSF；配好后分装-20℃保存，其中 PMSF和蛋白酶抑制剂量使用时现加。 - 裂解方法：
（1） 按1X106细胞/100uL的比例加细胞裂解液,混匀后冰浴30分钟；
（2） 12,000rpm, 4℃,离心10min；
（3） 实验时取25uL的上清加5uL 6X上样缓冲液煮沸5分钟使蛋白变性后，12000rpm离心5分钟，取上清和预染Marker加样电泳。或-80℃保存备用。
三、 细胞核蛋白质的提取
- 试剂准备
| 缓冲液A | 缓冲液B |
| 10mmol/L HEPES-KOH pH7.9 | 20mmol/L HEPES-KOH pH7.9 |
| 1.5mmol/L MgCL2 | 1.5mmol/L MgCL2 |
| 10mmol/L KCL | 420mmol/L NaCL |
| 0.5mmol/L DTT | 0.2mmol/L EDTA |
| 0.2mmol/L PMSF | 25% Glycerol |
| 0.5mmol/L DTT | |
| 0.2mmol/L PMSF |
- 操作步骤
（1） 去细胞培养液，用PBS（含0.05mmol/LPMSF）洗两次，用刮板将细胞刮下，计数细胞，收集于适当体积离心管，用少量PBS冲洗平皿一并吸入离心管。
（2） 4C 1000rpm离心5分钟，使细胞沉淀。
（3） 弃上清，将沉淀的细胞用含PMSF的PBS悬起再离心，重复两次。洗去全部细胞培养液及血清成分。
（4） 取5×105-7细胞，4C 1000rpm离心，弃上清。
（5） 加入400μl冷缓冲液A，手指弹管壁使沉淀悬起，冰浴10分钟，震荡10秒钟，混匀。
（6） 4C 14000rpm离心5分钟，弃上清，加20~100μl冷缓冲液B使沉淀悬起，冰浴20分钟。
（7） 4C 1000rpm离心10分钟，弃沉淀。
（8） 上清为核提取物，分装后-70C保存。（此法每1×106细胞可得到50~75μg核蛋白质）。
您好，在提取线粒体蛋白时，得到的线粒体沉淀用100uL裂解液处理，这里的裂解液是否是普通的RIPA+cocktail裂解液
王博好，不知道动物组织能否用您 的方法提取线粒体蛋白？
您好，这个没有试过，应该可以的，得保证单细胞悬液
谢谢王博回复！我看有人说将细胞匀浆到60%的细胞染色，您这里说90%，因为我后续需要做线粒体一些功能性的检测，同时也需要测线粒体蛋白，不知道如果匀浆到90%，线粒体完整性好不好？第二个问题是用玻璃匀浆器匀浆，可是美国的杜恩斯匀浆器好贵啊，我们实验室没有，可以用便宜的普通匀浆器不？好怕线粒体提不出来。。。
您好，想问一下核蛋白提取步骤中各步的离心条件，具体是多少转速呢。
您好，已经修改了 中间相关离心步骤时间可以延长
感谢回复，我按照您的实验方法进行了一次实验尝试，使用的是肝癌细胞。但我发现，在buffer处理细胞10分钟的条件下，细胞的细胞膜并没有完全裂开。在延长buffer A处理时间（20min）和buffer B（40min/期间每10分钟颠倒或震荡混匀）的处理后，依旧在胞核成分中发现了Tubulin。想询问一下是否还有更好的解决方式或实验条件呢。
你好哦 请问核蛋白提取操作（6）弃去的上清是不是可以作为细胞质蛋白。
是的，不好意思，刚刚看见
你好，我想问问从线粒体上提取出来的蛋白质里面应该是包括丙酮酸转运蛋白的吧？有什么手段可以将丙酮酸转运蛋白和另一种细菌的细胞膜融合起来呢？
你的意思是构建两个蛋白的融合蛋白？就是通过重组PCR将两个基因序列连起来，删除第一个的终止密码子，连接进质粒，转染细胞，在细胞内表达重组蛋白
您好，你的这个细胞核提取方法，提取的纯度是多少啊
您好 理想状态下一般可以达到90%以上，基本可以将核质或线粒体蛋白区分开。不过现在基本都有商品化试剂盒 其成分基本上也是这个基础上优化的