1.问：流式染色离心力如何选择？

答：若只是表面染色，细胞离心力推荐300 g~500 g，若细胞比较大（肿瘤细胞）300 g离心，细胞比较小（淋巴细胞）500 g离心，离心时间5~10 min。若是胞内染色，因涉及固定破膜过程，细胞会脱水变轻，因此需提高离心力，推荐离心力600~800 g，根据不同品牌的破膜剂及破膜时间来选择具体离心力，离心时间建议10~15 min。

2.问：流式染色时间及温度如何选择？

答：流式染色是抗原抗体的结合反应，此过程结合非常快，而且非常牢固，但染色过程要尽量让所有抗原都能结合抗体分子，所以加入抗体一定要混匀，我们一般选择室温染色15 min或者4℃染色30 min，染色中途混匀一次，建议轻弹管子（枪头吹打可能会对细胞受损，死细胞增多，导致非特异性结合增加）。

3.问：流式染色需要购买FcγR Blocking吗？

答：若染了同型对照，FcγR Blocking这一步骤可以省略，若没有染同型对照，只要是知道抗原清楚表达，细胞分群很明显的也不用FcγR Blocking，总之言之，绝大多情况下都不需要这一步骤。当然磁珠分选都要有这一过程，因为磁珠分群没有办法去除背景，Fc受体的结合对结果会影响很大（特别是分选免疫细胞）。

4.问：流式上样速度如何选择？

答：一般建议上样速度控制在10000个/秒以内，上样速度太高，容易堵塞吸样针，并且会导致检测不准确。

5.问：细胞体外放置多久仍可染色？

答：若细胞来不及处理，只有表面染色，细胞可放在4℃  6~12 h，对染色结果影响不大；若是胞内因子的染色需要及时处理，因细胞有刺激过程，需要细胞保证活性。对于凋亡染色、线粒体膜电位分析及检测胞内酶活性必须要及时染色。

6.问：流式染色需要购买Staining Buffer吗？

答：没必要，Staining Buffer的配方就是PBS加入1%BSA或FBS。可实验室自行配置。配置后最好过滤去除一些未溶解的颗粒，因颗粒杂质容易堵塞流式吸样管。

7.问：细胞固定后能染色吗？

答：建议固定后不要染色，因甲醛固定后会导致某些抗原表位的丢失（甲醛固定时细胞氨基基团会发生交联，从而掩盖抗原的表位），另外，残留的甲醛会和抗体分子非特异性结合，这些都会导致染色效率不高；若因不可抗拒原因需要固定后染色，一定要清楚固定后抗原是否受影响（可实验验证），建议PBS洗涤细胞两次后染色。

8.问：细胞染色后是否可以固定？

答：有时因实验安排，需要隔天检测，这时候需要固定细胞，一般我们用4%多聚甲醛（有成品的液体，也可买粉末自行配置）或者用荧光抗体保存液固定细胞，但如果染色的抗体颜色是耦联染料（PE-Cy5、PE-Cy7、PerCp-Cy5.5）不能固定，因为耦联染料在固定时会解偶联，这会导致荧光染料降解。荧光抗体保存液的配方是（ 2 g葡萄糖，1ml甲醛加到100 ml PBS里溶解后再加0.5ml  20%叠氮钠）。

9.问：细胞染色的阴性对照管如何设定？

答：若有同型对照，应以同型对照为阴性对照管，画门时，阴性对照管的比例应界定在0%~3%之间，这是默认的不表达。在没有设置同型对照时（可参照前文中同型对照章节的介绍），可用裸细胞来设置阴性对照管。

10.问：细胞自发荧光如何解决？

答：培养时间较久的原代细胞、药物处理（药物本身就有自发荧光）的细胞、植物细胞（含有叶绿素）、分泌核黄素的细胞、这些细胞自发荧光比较强，在流式染色中不能忽视，一般自发荧光在第一检测通道（FITC）和第二检测通道（PE）上干扰比较多，当然其他检测通道也有（特别是药物干扰），存在自发荧光的情况下，一定要注意对染色结果的影响（特别是做低表达抗原检测时），如果允许，尽量选择避开干扰的荧光染料。在做凋亡检测时，经常会遇到自发荧光干扰的问题，一定要注意选择避开干扰的Annexin V染料，如Annexin V-APC。