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PCR只要把引物设计的好,实验简直易如反掌,有同学留言要oligo6.0安装包,但是进哥电脑装不了,为此分享一下零基础版的Oligo7引物设计教程。

Oligo7软件安装

为防止大家和我以前一样在网上下载软件中毒,我提供一个无毒下载破解版链接:

链接:https://pan.baidu.com/s/1fqfQC2YqqpJhdlHZbZK5Zw
提取码:ogvp


下载解压后,点击开始安装,安装完后,点击桌面的Oligo7图标,弹出注册“OLIGO 7 Customer Registration”界面,此时你需要点击安装包内就会弹出“Oligo 7.0 Keymaker”界面。

图一

如图一左,将“OLIGO 7 Customer Registration”界面上原有的Workstation 数字复制粘贴到“Oligo 7.0 Keymaker”内的Workstation,然后点击Generate得到Access数字,将得到的Access数字粘贴回“OLIGO 7 Customer Registration”相应位置,单击“Confirm Code”按钮即可完成注册破解。

找到目的基因序列

找到目的基因序列才能针对设计引物,如果有同源蛋白还需要查找目的基因CDS序列取交集。以我研究的大鼠AQP1为例,先打开NCBI,选择Gene数据库,输入名字+物种,点击“Search”,弹出图二左,点击下方“AQO1”进入新界面,下拉点击右侧”RefSeq RNAs”,如图二右。

图二

新界面下拉,出现图三左,点击“CDS”出现图三右,复制途中棕色区域序列,即为我们目的基因的CDS序列。当然,如果没有同源蛋白的问题,你可以直接复制所有序列进行分析。

图三

设计引物序列

打开Origin7,点击“File”下拉菜单里的“New Sequence”,将序列粘贴在窗口里如图四,点击“√”就可以进入分析界面。

图四

新界面里点击“Search”,点击“for Primers & Probes”如图五左上,然后界面弹出图五右上,点击“Parameters”和“Ranges”,根据反应条件设置参数,一定要修改引物长度,防止引物过短,我习惯修改为图四下,然后点击“Search”就可以自动得到结果。

图五

Oligo7自动给出了可能的引物对,只需要点击右侧框内“Score”,引物按软件认为的优劣进行排序,你可以看到引物的关键信息,比如长度,Ta值,GC含量。我这里参数设置少所以图六内结果多,一般限定多个参数后,软件只给出几对引物。

图六

分析引物并选择

选择一条引物,点击上方“Analyze”,然后点击“Key info”内的“Selected Primers”,会弹出两条引物的序列和其他概括信息如图七。这里需要确保|3`△G|≤9kcal/mol,以防止在错配位点形成双链结构引起DNA聚合反应。

图七

满足图七后,要继续进行6项分析以确保自己的引物是最合适的,这6项我在图八中已经标识,我接下来将结合自身经验逐一细讲。

图八

①二聚体形成分析:为了防止引物之间相互形成二聚体,我们需要点击“Duplex Formation”分析“Forward Primer”,“Reverse Primer”,确保△G≤4.5kcal/mol,hydrogen bonds≤3,如图九右。求稳的话还要分析“Upper Oligo”和“Lower Oligo”,那样可以阻止上下游引物之间形成二聚体。

图九

②发卡结构分析:为了阻止发卡结构形成,需要选择菜单内“Hairpin Formation”,分析“Forward Primer”,“Reverse Primer”,同①一样要确保△G≤4.5kcal/mol,hydrogen bonds≤3。

③碱基组成与Tm值:点击图八中的3的“Composition&Tim”分析,按规矩需要控制上下游引物GC含量在40%-60%,上下游引物GC含量也不可以差太大,但其实实际中,引物GC含量70%我也扩成功过,上下游引物GC含量差10%也可以做,所以请根据自己实际情况抉择,在Oli’go7里分析的结果给出的参数很多,你只要看我图十左里红圈的两个参数即可。

图十

④错误引发位点:点击“False Priming Sites”即可以分析。个人感觉实践中意义不大,因为往往正确概率很高如图十右,错误概率即使达到130问题也不大,所以大家这里自己抉择吧。

⑤PCR总览如果你的引物有太明显的问题,在这个界面的“Comments”下方白框里会出现如图十一右的红字提示,那么你就需要根据提示修改或者更换引物。如果没有,则会和图十一左“Comments”内为空白,你只需要根据这里提供的Tm值,然后减5,就是你设计的这条引物的退火温度。

图十一

⑥内稳定性:上述分析完后,点“Internal stability”这个选项,最好弹出来的曲线图像如图十二:中间高两边低的弧,这样的引物稳定性高,成功概率更高,其实实践中如果做不到问题也不是很大。

图十二

7 Replies to “从0开始,准确又快速利用Oligo7设计PCR引物”

  1. 哈哈哈,我也是各种学习,我甚至都吃了把狗粮哈哈哈,网站做的真好。

  2. 师兄你好,请问用Oligo设计的引物不从起始密码子开始,终止密码子结束,那我克隆出来的基因会和我的目的基因一样吗?上次我用primer premier6设计引物,发现跑不出条带,我在想有没有可能不同模板表达量不同所以克隆不出来,因为我用之前克隆出来的基因上次也没有跑出来,请问这种可能存在吗?谢谢!

    1. 同学你好,你是要扩CDS全长构建过表达质粒是吗?这个引物设计不需要用软件,因为首尾已经限定了,只能在正反义链各取15-20碱基,加上酶切位点以及Kozak序列(上游引物)去合成引物,这样才能扩基因CDS全长。当然因为限定了 ,所以有可能设计的引物很难扩增出来,可以换思路,用不同策略扩增目的基因,比如巢式PCR,重组PCR等。
      这两个软件主要是扩增一段序列的时候去用,比如qPCR、启动子结合位点序列等等

      1. 谢谢师兄这么详细的回复,太感谢了,您的博客真的帮到我很多!

  3. 本来只是想求一个安装包,没想到进哥直接给配了一篇安装+使用教程,真的是很感动,对于我们这些小白来说,真的是太友好了!

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