就看着大家一直在问WB的内参咋调啊，上样量总是不齐啊咋办。我想说，你们还是太保守了……WB就光是调内参的事么？于是夏老师就随便找了篇9.517分的Sci Signal，给你们上一课：

首先，第一点，WB样本的准备。是不是都觉得不算啥问题？就裂解液一裂解就行了？

最常用的裂解液事RIPA缓冲液，一般会含有SDS和脱氧胆酸钠，这都是蛋白去污剂。但是即使是这样，缓冲液都会产生不溶性部分。他们分析了RIPA裂解后的上清(Sup)以及不溶性颗粒(Pel)中的WB，结果发现：

看到了？H3K4二甲基化的蛋白，几乎不能溶解……其他也有一些蛋白，是部分溶解在上清中的。

而不同的裂解液，可能也对最终的结果产生影响。这里他们用RIPA裂解缓冲液、NP40裂解缓冲液（缺乏 SDS 和脱氧胆酸盐）和 Laemmli 样品裂解缓冲液（含有二硫苏糖醇）分析。他们首先激活了FAS，促进凋亡激活。这个还记得么？给你们讲过的喔……

凋亡激活后，下游的Caspase3和Caspase8会被剪切成成熟体。但是不同的裂解液，最终会导致剪切后的成熟体检测结果不同：

只有 Laemmli 样品裂解缓冲液处理，才能检测到有成熟体的Caspase8。所以，裂解缓冲液有多重要，直接能影响你的检测结果。

有时大家会认为 RIPA 中的 SDS 和脱氧胆酸盐会使大多数细胞酶失活。所以在做磷酸化WB的时候，不再加磷酸酶抑制剂……但实际上结果是：

很明显，只有加入了磷酸酶抑制剂，才能获得更好的磷酸化WB的结果。

对于WB，是不存在适用于所有电泳转移设置和检测方法的单一方案的。所以刚开始预实验，就先要通过样本的连续稀释，找到最佳的上样量：

如果是线性的，就还好，但如果是指数型或者幂函数曲线，就需要取较为线性的区段中的上样量了：

除了这些，甚至不同的WB发光成像试剂，对于不同的蛋白，都会有不同的线性结果：

最后样本结果需要稳定，合适的内参选择也很重要，这个之前也给你们介绍过，如何选择WB的内参了。好的内参，在样本间的CV值较低。

其实很多文献都建议用总蛋白含量来代替内参，可以获得更稳定的结果。