CRISPR/Cas9筛选流程：

1. 文库构建：针对某个物种，每个基因设计3个或以上的sgRNA，高通量合成sgRNA，然后把合成的sgRNA克隆到慢病毒载体中。

2. 慢病毒转导：包装GeCKO慢病毒文库，并以低MOI（一般标准<0.3）感染靶细胞，保证一个病毒颗粒感染一个细胞，筛选同时表达sgRNA和Cas9的细胞；每个细胞都只会敲除自身携带的sgRNA对应的一个基因，细胞文库中包含的细胞的数量一般为细胞文库中全部sgRNA数量的100-1000倍。

3. 表型筛选：将全基因组敲除细胞库分成两份，其中一份作为实验组施加筛选压力，如：病毒侵染，药物治疗等；另一份作为对照组。根据耐药性、增殖能力、存活能力等表型筛选细胞。

4. 候选基因的分析：将实验组和对照组的细胞分别抽提基因组，PCR扩增sgRNA片段，高通量测序，并进行生物信息学分析。

根据筛选目的的不同，分为阳性筛选和阴性筛选。阳性筛选是对已成功整合sgRNA的细胞文库施加一定的筛选压力，仅使少数目的表型的细胞能够存活，达到富集关键基因的目的。阴性筛选与之相反，存活的细胞并不是目的表型细胞，需要比较不同时间点sgRNA的丰度找出差异sgRNA来确定关键基因，阴性筛选可以鉴定出引起细胞某些功能缺失的基因，如筛选时间较长，可以筛选到细胞生存所必需的基因。

个人理解：阳性、阴性筛选或者正向、负向筛选听起来容易混淆，其实在英文中就2个词，positive selection和negative selection，无论怎么选择，最后都是看sgRNA的计数情况，然后根据实验目的确定候选基因。如果最后选出的细胞内富集的sgRNA所靶向的基因就是我们要的目的基因，那么这种选择我们称其为positive selection。相反，如果最后富集的sgRNA并不是我们实验想要的，我们通过比较不同时间点的sgRNA变化进而推断候选基因，这样的选择称之为negative selection。举个例子，我们要筛选细胞生长的必需基因，如果把这个基因敲除了（这个基因由其对应的sgRNA作为标记，每个细胞内都敲除了一个基因），那么细胞肯定不能存活了，对应的sgRNA肯定也不会富集。所以存活的细胞意味着没有敲除必需基因，随着细胞的增值，整合到其基因组上的sgRNA大量富集，我们最终测到了这些sgRNA，但其靶向的基因敲除了并不影响细胞生长，所以这些基因不是目的基因。因此我们比较不同时间点sgRNA的消耗情况，那些sgRNA明显减少的，其靶向的基因才是必需基因。

那么什么情况下是positive selection？我们知道，这两者是反的，所以假如我们想筛选细胞生长的抑制基因（和必需基因相反），这种情况就属于positive selection（和negative selection相反）。如果敲除了抑制基因，显然细胞可以正常增值，抑制基因对应的sgRNA也能不断富集，这两个方向是相同的。

如果富集sgRNA靶向的基因就是目的候选基因，则为positive selection，否则为negative selection。

阳性筛选实例：

①筛选炭疽毒素使细胞中毒所必需的宿主基因

由于毒素的强选择性压力，大多数细胞都会死亡，只有少量的细胞存活和增殖，这些存活的细胞内富集了大量sgRNA，而这些sgRNA靶向的基因是被敲除的，这些基因就是使细胞中毒所必需的宿主基因，正是由于这些目的基因被敲除，细胞才得以存活。

Zhou等（2014）利用敲除文库筛选，在初步确定的291个基因中成功鉴定出炭疽和白喉毒素致细胞中毒所必需的宿主基因，并通过功能验证得到了证实。

②筛选药物敏感基因

细胞若含有药物敏感基因将失去抗药性。若敲除了敏感基因，则可以存活，最终富集的sgRNA正是实验目的需要的sgRNA。

阴性筛选实例：

①鉴定细胞生长必需的基因

一个时间段内的连续生长，减少的细胞中往往携带靶向细胞增殖所必需基因的sgRNA。这些基因可以通过比较每个sgRNA的相对频率来找到。阴性筛选的一个重要应用是鉴定癌细胞生长所必需的基因，而这些基因可能成为治疗癌症的新靶标。

2014年，Shalem等首次利用GeCKO文库鉴定出人黑色素瘤细胞和多能干细胞存活的关键基因，研究结果与RNAi筛选结果高度一致。

②筛选药物抗性基因

若敲除了抗药性基因，细胞在药物压力下不能存活，存活的细胞内并没有敲除目的基因，最终富集的sgRNA不是目的sgRNA，需要通过与对照组比较sgRNA消耗情况（或不同时间点的sgRNA丰度）来确定目的基因。

生物信息学分析：

1. 测序数据质控，去除低质量的reads，使用clean reads data进行后续分析。

2.比对分析：将测序数据中拼接reads与sgRNA 文库序列比对，并对sgRNA 文库中完全匹配的sgRNA 数目、丢失sgRNA、基尼指数等进行统计。

•Reads: Total number reads in the fastq file. (Recommended: 100~300 times the number of sgRNAs)

• Mapped: Reads that can be mapped to gRNA library

• Percentage: The percentage of mapped reads (Recommended: at least 60%)

• TotalsgRNAs: The number of sgRNAs in the library

• ZeroCounts: The number of sgRNA with 0 read counts(Recommended: no more than 1%)

• GiniIndex: The Gini Index of the read count distribution. Gini index can be used to measure the evenness of the read counts, and a smaller value means a more even distribution of the read counts. (Recommended: around 0.1 for plasmid or initial state samples, and around 0.2-0.3 for negative selection samples )

3.sgRNA 及基因的read counts 统计

CRISPR全基因组筛选的主要内容便是统计sgRNA在不同样本间的消耗和富集情况，进而推断候选基因。

4.主成分分析和样品相关性聚类分析

有助于考察样本间的相似性和差异，评估实验设计的合理性以及对后续数据分析起到一定指导作用。对于有重复的实验来说，样本同一处理不同重复应该尽可能聚在一起，若存在个别重复样本明显偏离，可以考虑剔除该样本。样品聚类还可用于判断数据处理中是否剔除了批次效应。

5.候选基因筛选

MAGeCK-RRA算法根据测序结果中sgRNA的富集情况产生对应基因位点的RRA得分，RRA得分代表基因的必要性，RRA得分越小表明其重要性越高。MAGeCK返回RRA lo value（neg|score、pos|score）检验统计显著性，并据此对基因进行了排序，按照实验目的的不同，候选基因筛选可分为正向筛选和负向筛选，筛选指标一般参考lfc（log2 fold change）和FDR（adjusted-pvalue），比如：根据lfc<-2且FDR<0.05进行负向筛选，lfc>2且FDR<0.05进行正向筛选。

6.GSEA富集分析

对CRISPR筛选得到的候选基因进行富集分析以了解基因的更多功能，同时也可以对CRISPR筛选结果进行验证，以便对潜在候选基因开展进一步研究。

GSEA enrichment analysis

参考文献：

[1]刘燕飞. 基于CRISPR/Cas9技术的HeLa细胞全基因组敲除文库的建立及初步应用[D].中国农业科学院,2020.

[2]Shalem,Ophir, et al. “Genome-Scale CRISPR-Cas9 Knockout Screening in Human Cells.”Science, vol. 343, no. 6166, 2014, pp. 84–87.

[3]Zhou, Yuexin, et al. “High-Throughput Screening of a CRISPR/Cas9 Library for Functional Genomics in Human Cells.” Nature, vol. 509, no. 7501, 2014, pp. 487–491.

[4]Kweon, Jiyeon, and Yongsub Kim. “High-Throughput Genetic Screens Using CRISPR-Cas9 System.” Archives of Pharmacal Research, vol. 41, no. 9, 2018, pp. 875–884.

[5]Li, Wei, et al. “Quality Control, Modeling, and Visualization of CRISPR Screens with MAGeCK-VISPR.” Genome Biology, vol. 16, no. 1, 2015, pp. 281–281.

[6]Wang, Binbin, et al. “Integrative Analysis of Pooled CRISPR Genetic Screens Using MAGeCKFlute.” Nature Protocols, vol. 14, no. 3, 2019, pp. 756–780.

作者：打工仔小刘
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来源：简书
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