- 寻找 CDS 序列
NCBI、Ensembl数据库均可以，本人更喜欢Ensembl：http://www.ensembl.org/index.html?redirect=no
2. 分析酶切位点：找出载体多克隆位点 MCS 有，而插入基因中无的酶切位点。
原因：如果序列中也有，酶切会把目的基因CDS序列切开
3. 添加保护碱基和 Kozak 序列
Kozak 序列（GCCACC AUG G）是真核生物 5’帽子结构后面的一段核酸序列，可以与翻译起始因子结合，介导含有 5’帽子结构的 mRNA 的翻译起始。对应原核生物的 SD 序列。核糖体可以识别这段序列，并且作为翻译起始位点。
4. 验证引物是否适合 PCR： （不适合也没办法，载体引物的局限性），只看与目的基因互补配对的部分（目的基因 CDS 序列），引物 Tm 值也只计算与目的基因完全互补配对的部分。
5. PCR—>回收—>酶切—>连接—>转化—>筛选—>摇菌—>抽质粒
基因克隆引物设计小程序已整合到进哥的toolkit中，有疑问请留言：
老师您好，请问酶切位点的保护碱基只需要加5’一端吗？另一端的不需要加吗？（看到其他视频加了两端，所以想在这里请教一下）
视频中如果没有5‘端和3’端，过表达结果可能会异常过高或者过低，因为缺乏调控。请教一下，正常一般范围是多少。我用质粒过表达后，PCR结果提示上调大约5倍，这个属于过低吗？
实验室有人用病毒过表达，他PCR结果是上调了50倍。
还有想请教一下，瞬转之后进行PCR检测，使用的引物，就用正常目的基因的引物就可以吧。
谢谢！
你好，RNA水平5倍确实不高，但是应该也够了，过低可能是转染效率过低所致，也就是只有少数细胞转进去了。如果有荧光可以看一下效率。病毒一般效率更高，所以上升倍数更高是正常的，
您好，shRNA和过表达的对照序列，应该怎么设计呢
这个简单，找一个无关序列
哈哈 其实就是人没有的序列，比如GFP绿色荧光蛋白，前提质粒上没有这个，其它任何人没有的都可以
进哥，下游引物的酶切位点和保护碱基需要反向互补么？
哈哈 你可以试一下 反向互补和原序列一样的，常规酶切位点序列是回文序列。
简单点说，不用你做任何变化，直接加5‘端即可’
你好！问一下，1.原核表达正向引物有必要加Kozak序列吗？
2.NCBI上根据目的基因（900bp）设计引物，PCR扩增时发现产物片段短了200bp，可能是什么原因？谢谢！
你好，1.原核不用加的，这是真核表达需要的
2. 可以先查一下目的基因有没有可变剪切产生的不同转录本，可能扩出的其它转录本，实在不清楚可以考虑测序先，PCR产物直接测 第二天就知道结果了