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一 载体简要说明

1 克隆gDNA使用BsmBI酶切位点,载体可以切出1.9kbfilter,便于确定载体酶切成功,并且利于胶回收。

2 BsmBI酶切位点如图酶切后不需要用CIP脱磷,也不会自连。

3cas9C端有FLAG,可以WBImmunostaining来检测。

4 EFS被优化的小而强,方便慢病毒的包装,极大的提高了慢病毒包装的效率。

5 优化的内部核糖体插入位点P2A,可以在只有EFS启动的情况下独立表达puromycin来筛选转染或感染成功的细胞。

gDNA设计说明

对于lentiCRISPR V2克隆,其合成的oligo末端与px330不同如下图所示:

具体举例如下:一定注意oligo的方向,载体的hU6的下游正义链一定是基因组序列的有义链,否则编辑无效,5’端必须第一个碱基必须是G如果不是G也要认为加一个G满足U6启动子的需求。

将引物稀释 100uM 后,再 10 倍稀释

退火

50ul 体系

引物  20ul(上下游各 10ul)、  25ulNEB buffer 210*5ul    955min。然后关闭 PCR 仪,自然降温 40min

LentiCRISPR V2 载体酶切

200ul体系: 

BsmBI  2ul10*buffer 20ul  质粒 10ul2ug); 16ul                55℃,酶切 2 小时 胶回收

连接

2*solutionI 5ul

退火引物   4.5ul

线性化载体 0.5ul             16℃连接过夜,转化挑菌送测序。

12 Replies to “LentiCRISPR V2载体使用说明”

      1. 最近想做这方面试验,求购该质粒以及慢病毒包装的其他几个质粒 谢谢!

  1. 请问一下,这个载体的测序引物是EF-1a吗?我在网站里查到的是这个引物。但是我送公司测序都是无信号。谢谢!

    1. 你要读懂质粒那个圈的,插入片段的上游有U6 promotor,负责转录sgRNA;下游有EF1-a,负责转录cas9;所以两种选择,U6 forward primer或EF1-a reverse primer

      1. 您好,我们组LentiV2质粒测序用的引物是LKO1-5,请问为什么选择这个引物呀?分子克隆小白,还请您帮忙解答一下,谢谢啦

        1. 您好,建议您下载序列用snapgene软件查看质粒图谱,或者直接在addgene网站查看图谱,我这边简单解释一下:
          LKO1-5:GACTATCATATGCTTACCGT 这个引物序列是在U6启动子正义链上,按照5–>3’进行测序,而sgRNA在这个治理上是由U6启动子启动转录的,因此,从U6往下测序就可以确定你的sgRNA是否插入。
          我常用的是EF1-a-R,这个引物结合的是EF1-a的反义链,ef-1a位于sgRNA下游,因此EF-1a-R引物往反方向测序也可以证实是否插入
          你理解一下 根据图谱不难理解

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