Posted on

一 载体简要说明

1 克隆gDNA使用BsmBI酶切位点,载体可以切出1.9kbfilter,便于确定载体酶切成功,并且利于胶回收。

2 BsmBI酶切位点如图酶切后不需要用CIP脱磷,也不会自连。

3cas9C端有FLAG,可以WBImmunostaining来检测。

4 EFS被优化的小而强,方便慢病毒的包装,极大的提高了慢病毒包装的效率。

5 优化的内部核糖体插入位点P2A,可以在只有EFS启动的情况下独立表达puromycin来筛选转染或感染成功的细胞。

gDNA设计说明

对于lentiCRISPR V2克隆,其合成的oligo末端与px330不同如下图所示:

具体举例如下:一定注意oligo的方向,载体的hU6的下游正义链一定是基因组序列的有义链,否则编辑无效,5’端必须第一个碱基必须是G如果不是G也要认为加一个G满足U6启动子的需求。

将引物稀释 100uM 后,再 10 倍稀释

退火

50ul 体系

引物  20ul(上下游各 10ul)、  25ulNEB buffer 210*5ul    955min。然后关闭 PCR 仪,自然降温 40min

LentiCRISPR V2 载体酶切

200ul体系: 

BsmBI  2ul10*buffer 20ul  质粒 10ul2ug); 16ul                55℃,酶切 2 小时 胶回收

连接

2*solutionI 5ul

退火引物   4.5ul

线性化载体 0.5ul             16℃连接过夜,转化挑菌送测序。

3 Replies to “LentiCRISPR V2载体使用说明”

  1. 请问一下,这个载体的测序引物是EF-1a吗?我在网站里查到的是这个引物。但是我送公司测序都是无信号。谢谢!

    1. 你要读懂质粒那个圈的,插入片段的上游有U6 promotor,负责转录sgRNA;下游有EF1-a,负责转录cas9;所以两种选择,U6 forward primer或EF1-a reverse primer

发表评论

邮箱地址不会被公开。 必填项已用*标注