一 载体简要说明
1 克隆gDNA使用BsmBI酶切位点，载体可以切出1.9kb的filter，便于确定载体酶切成功，并且利于胶回收。
2 BsmBI酶切位点如图酶切后不需要用CIP脱磷，也不会自连。
3在cas9的C端有FLAG，可以WB或Immunostaining来检测。
4 EFS被优化的小而强，方便慢病毒的包装，极大的提高了慢病毒包装的效率。
5 优化的内部核糖体插入位点P2A，可以在只有EFS启动的情况下独立表达puromycin来筛选转染或感染成功的细胞。
二 gDNA设计说明
对于lentiCRISPR V2克隆，其合成的oligo末端与px330不同如下图所示：
具体举例如下：
一定注意oligo的方向，载体的hU6的下游正义链一定是基因组序列的有义链，否则编辑无效,且5’端必须第一个碱基必须是G如果不是G也要认为加一个G满足U6启动子的需求。
将引物稀释 100uM 后，再 10 倍稀释
退火
50ul 体系
引物 20ul（上下游各 10ul）、水 25ul、NEB buffer 2（10*）5ul 95℃，5min。然后关闭 PCR 仪，自然降温 40min。
LentiCRISPR V2 载体酶切
200ul体系：
BsmBI 2ul；10*buffer 20ul； 质粒 10ul（2ug）；水 16ul 55℃，酶切 2 小时 胶回收
连接
2*solutionI 5ul
退火引物 4.5ul
线性化载体 0.5ul 16℃连接过夜，转化挑菌送测序。
王老师，您好，我想请问一下您有推荐用来设计oligo的软件吗？我在Thermo里面有些目的基因的oligo设计不出来
一文掌握gRNA的设计，常用方法汇总解析 – 王进的个人网站
https://www.jingege.wang/2020/12/18/5041/
这几个你都试试看哈 有很多这样的工具
“对于lentiCRISPR V2克隆，其合成的oligo末端与px330不同如下图所示：
具体举例如下：一定注意oligo的方向，载体的hU6的下游正义链一定是基因组序列的有义链，否则编辑无效,”
请问一定U6后为什么一定要是基因有意链呢？sp cas9切割的是基因组的双链，理论上来说不是有意义链也能切割引起突变吧
您好，您说的对，这边描述错了 谢谢提醒 这是网上转过来收藏的 没有仔细看 我现在修改一下
不是 刚刚又看了一下，没有问题 这里强调的是方向问题 只是它的描述容易产生误解。意思是需要U6启动子转录出sgRNA，注意双链oligo的正反，而这个sgRNA靶向的可以是正义或反义链
您好，请问酶切体系是200微升吗？我看您这里写的加起来是48微升。
CRISPR-Cas9 sgRNA设计和载体构建
不好意思，这个文章里有点乱
参考上面那个文章的体系，我用的也是这个
请问做不同种属的细胞敲除，比如质粒上原来是人源的U6启动子，现在想做鼠源细胞的敲除，需要把U6启动子换成鼠源的吗？
RNA聚合酶III识别结合U6启动子，应该是要种属特异性才能保证最大效率
好的，谢谢！
你好 这个LentiCRISPR V2质粒可以分享下吗 谢谢
可以的 加微信交流
大佬您好，请问这个质粒或菌株您还有吗？
您好 大佬不敢 这些质粒当然有的
最近想做这方面试验，求购该质粒以及慢病毒包装的其他几个质粒 谢谢！
你加我微信了是吧 微信联系
请问一下，这个载体的测序引物是EF-1a吗？我在网站里查到的是这个引物。但是我送公司测序都是无信号。谢谢！
你要读懂质粒那个圈的，插入片段的上游有U6 promotor，负责转录sgRNA；下游有EF1-a，负责转录cas9；所以两种选择，U6 forward primer或EF1-a reverse primer
好的，谢谢解答！
您好，我们组LentiV2质粒测序用的引物是LKO1-5，请问为什么选择这个引物呀？分子克隆小白，还请您帮忙解答一下，谢谢啦
您好，建议您下载序列用snapgene软件查看质粒图谱，或者直接在addgene网站查看图谱，我这边简单解释一下：
LKO1-5：GACTATCATATGCTTACCGT 这个引物序列是在U6启动子正义链上，按照5–>3’进行测序，而sgRNA在这个治理上是由U6启动子启动转录的，因此，从U6往下测序就可以确定你的sgRNA是否插入。
我常用的是EF1-a-R，这个引物结合的是EF1-a的反义链，ef-1a位于sgRNA下游，因此EF-1a-R引物往反方向测序也可以证实是否插入
你理解一下 根据图谱不难理解
理解了，谢谢王老师，开心