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CRISPR-Cas9 sgRNA设计和载体构建
以这个方案为准

一 载体简要说明

1 克隆gDNA使用BsmBI酶切位点，载体可以切出1.9kb的filter，便于确定载体酶切成功，并且利于胶回收。

2 BsmBI酶切位点如图酶切后不需要用CIP脱磷，也不会自连。

3在cas9的C端有FLAG，可以WB或Immunostaining来检测。

4 EFS被优化的小而强，方便慢病毒的包装，极大的提高了慢病毒包装的效率。

5 优化的内部核糖体插入位点P2A，可以在只有EFS启动的情况下独立表达puromycin来筛选转染或感染成功的细胞。

二 gDNA设计说明

对于lentiCRISPR V2克隆，其合成的oligo末端与px330不同如下图所示：

具体举例如下：

一定注意oligo的方向，载体的hU6的下游正义链一定是基因组序列的有义链，否则编辑无效,且5’端必须第一个碱基必须是G如果不是G也要认为加一个G满足U6启动子的需求。

将引物稀释 100uM 后，再 10 倍稀释

退火

50ul 体系

引物  20ul（上下游各 10ul）、水  25ul、NEB buffer 2（10*）5ul    95℃，5min。然后关闭 PCR 仪，自然降温 40min。

LentiCRISPR V2 载体酶切

200ul体系： 

BsmBI  2ul；10*buffer 20ul；  质粒 10ul（2ug）；水 16ul                55℃，酶切 2 小时 胶回收

连接

2*solutionI 5ul

退火引物   4.5ul

线性化载体 0.5ul             16℃连接过夜，转化挑菌送测序。

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By 进哥哥Tags: ,

31 Replies to “LentiCRISPR V2载体使用说明”

  1. 您好，在我们组既往送测序的单子上，我看测序的目的片段长度是25bp，请问这个是根据什么得出的。

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  2. 您好，王老师，LentiCRISPR V2质粒中插入2个sgRNA，PCR验证的时候需要加两对引物吗，PCR产物的大小我也不确定，是两个引物的长度和，还需要加上同源臂的长度吗？

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  3. 请问这个质粒上的bleoR可以在动物细胞中表达吗？bleoR抗性可以用来筛选细胞吗？

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    1. 朋友，你后来有用电转尝试吗？我老板让我用瞬转，但我瞬转没成功。有前辈告诉我说这个质粒不适合做瞬转，可以考虑一下电转

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    2. 您好，我也想知道V2-GFP-P2A-Puro质粒可以电转吗，您有结论了吗？

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  8. 您好，想请问LentiCRISPR V2包装慢病毒时，三质粒的转染比例是取的多少呢？

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  10. 王老师，您好，我想请问一下您有推荐用来设计oligo的软件吗？我在Thermo里面有些目的基因的oligo设计不出来

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  11. “对于lentiCRISPR V2克隆，其合成的oligo末端与px330不同如下图所示：

    具体举例如下：一定注意oligo的方向，载体的hU6的下游正义链一定是基因组序列的有义链，否则编辑无效,”

    请问一定U6后为什么一定要是基因有意链呢？sp cas9切割的是基因组的双链，理论上来说不是有意义链也能切割引起突变吧

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    1. 您好，您说的对，这边描述错了 谢谢提醒 这是网上转过来收藏的 没有仔细看 我现在修改一下

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    2. 不是 刚刚又看了一下，没有问题 这里强调的是方向问题 只是它的描述容易产生误解。意思是需要U6启动子转录出sgRNA，注意双链oligo的正反，而这个sgRNA靶向的可以是正义或反义链

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  12. 您好，请问酶切体系是200微升吗？我看您这里写的加起来是48微升。

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  13. 请问做不同种属的细胞敲除，比如质粒上原来是人源的U6启动子，现在想做鼠源细胞的敲除，需要把U6启动子换成鼠源的吗？

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      1. 最近想做这方面试验，求购该质粒以及慢病毒包装的其他几个质粒 谢谢！

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  16. 请问一下，这个载体的测序引物是EF-1a吗？我在网站里查到的是这个引物。但是我送公司测序都是无信号。谢谢！

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    1. 你要读懂质粒那个圈的，插入片段的上游有U6 promotor，负责转录sgRNA；下游有EF1-a，负责转录cas9；所以两种选择，U6 forward primer或EF1-a reverse primer

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      2. 您好，我们组LentiV2质粒测序用的引物是LKO1-5，请问为什么选择这个引物呀？分子克隆小白，还请您帮忙解答一下，谢谢啦

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        1. 您好，建议您下载序列用snapgene软件查看质粒图谱，或者直接在addgene网站查看图谱，我这边简单解释一下：
          LKO1-5：GACTATCATATGCTTACCGT 这个引物序列是在U6启动子正义链上，按照5–>3’进行测序，而sgRNA在这个治理上是由U6启动子启动转录的，因此，从U6往下测序就可以确定你的sgRNA是否插入。
          我常用的是EF1-a-R，这个引物结合的是EF1-a的反义链，ef-1a位于sgRNA下游，因此EF-1a-R引物往反方向测序也可以证实是否插入
          你理解一下 根据图谱不难理解

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