一 载体简要说明

1 克隆gDNA使用BsmBI酶切位点，载体可以切出1.9kb的filter，便于确定载体酶切成功，并且利于胶回收。

2 BsmBI酶切位点如图酶切后不需要用CIP脱磷，也不会自连。

3在cas9的C端有FLAG，可以WB或Immunostaining来检测。

4 EFS被优化的小而强，方便慢病毒的包装，极大的提高了慢病毒包装的效率。

5 优化的内部核糖体插入位点P2A，可以在只有EFS启动的情况下独立表达puromycin来筛选转染或感染成功的细胞。

二 gDNA设计说明

对于lentiCRISPR V2克隆，其合成的oligo末端与px330不同如下图所示：

具体举例如下：一定注意oligo的方向，载体的hU6的下游正义链一定是基因组序列的有义链，否则编辑无效,且5’端必须第一个碱基必须是G如果不是G也要认为加一个G满足U6启动子的需求。

将引物稀释 100uM 后，再 10 倍稀释

退火

50ul 体系

引物  20ul（上下游各 10ul）、水  25ul、NEB buffer 2（10*）5ul    95℃，5min。然后关闭 PCR 仪，自然降温 40min。

LentiCRISPR V2 载体酶切

200ul体系： 

BsmBI  2ul；10*buffer 20ul；  质粒 10ul（2ug）；水 16ul                55℃，酶切 2 小时 胶回收

连接

2*solutionI 5ul

退火引物   4.5ul

线性化载体 0.5ul             16℃连接过夜，转化挑菌送测序。