一、实验材料准备
1. BALB/c nu/nu裸鼠40只，雄性，4-6周龄，体重18-20 g，无特定病原体(SPF)级饲养。
2. 肺腺癌细胞株A549，用含10%小牛血清的RPMI 1640培养基(美国Gibcobrl公司)，5% CO237℃培养，常规传代。
3. 质粒和筛选药物质粒pCDH-eGFP，携带嘌呤霉素(puro)耐药基因供筛选，在CMV启动子控制下编码eGFP作为转染标记物。嘌呤霉素(puro)筛选。
二、细胞的转染
1. 哺乳动物磷酸钙转染系统(美国Promega公司)，按照操作指南将质粒pCDH-eGFP转入A549细胞，转染后24~48 h荧光显微镜下观察转染效率。
2. 后培养液内加嘌呤霉素(puro)筛选获得稳定转染。
3. 利用平板克隆形成试验测定细胞克隆形成率>10%后，有限稀释法获得表达GFP阳性细胞。
4. 1月后收获转染细胞，常规传代培养，培养液中加嘌呤霉素(puro)维持筛选。
5. 测定转染后A549细胞增殖动力学指标，对比转染前后A549细胞生长曲线，检测转染后细胞的生长活性是否受转染的影响。
6. 待细胞增殖达一定数量后，裸鼠皮下注射转染前后细胞，记录成瘤时间，用公式V=1/2x长x宽 计算肿瘤体积，对比转染前后两组裸鼠的瘤体大小以检测成瘤性是否有差别。
三、裸鼠肿瘤细胞移植时的简要步骤
首先准备好要移植的肿瘤细胞（细胞量根据不同肿瘤略有不同，例如所用的前列腺癌细胞系每个移植点一般选择 1×106左右；肿瘤细胞可与基质胶 1:1 混匀后用 1 ml 注射器吸取，基质胶能够给肿瘤细胞提供营养环境，有助于肿瘤细胞生长）。
戴无菌手套后，将小鼠用左手大拇指和食指捏住颈部皮肤，然后将鼠尾用左手无名指和小指固定于左手大鱼际。将腋窝或腹股沟用 75% 酒精消毒 3 次。右手持吸有肿瘤细胞和基质胶混合液的注射器，在腹股沟或腋窝的位置，45 度斜角进针，注意不要突破腹膜，将针头保持于皮下位置。
然后近水平位置将针头几乎完全插入皮下，将混有基质胶的肿瘤细胞注射入皮下（肿瘤细胞量约 1×106），快速退针，左手食指轻压针孔约 1 min 后将小鼠放回饲养笼中，注意将小鼠侧放于垫料上，放置其不适呕吐时呕吐物误入呼吸道引起窒息。2～3 h 后观察小鼠是否苏醒。
如果是利用肿瘤组织（人体肿瘤标本或小鼠移植瘤传代）建立裸鼠皮下移植瘤模型，则需要首先将肿瘤组织用无菌 PBS（或 1640 培养基）洗涤 3次，然后在无菌平皿上切成或用无菌剪刀剪成<1 mm3 体积的小块（种植前可裹基质胶）备用。
将小鼠用水合氯醛麻醉后平卧于解剖板上，四肢用胶带固定，将腋窝或腹股沟用 75% 酒精消毒 3 次，然后用眼科剪剪开约 0.5 cm 小口，小镊子将皮下筋膜与皮肤分开，然后将肿瘤组织放入贴近腹股沟或腋窝的深部，每个位置放置 2～3 块肿瘤组织，注意不同组间统一放置肿瘤组织块数以保持一致。
然后缝合皮肤，消毒后将小鼠侧卧位放置于饲养笼的垫料上。2～3 h 后观察小鼠是否苏醒。
四、裸鼠肿瘤模型肺原位成瘤方法介绍实验步骤：
（1）、准备足量细胞,将处于对数生长期的各实验组成瘤细胞胰酶消化后,完全培养基重悬成细胞悬液；
（2）、用血球计数板对细胞进行计数,并最终用一定体积基质胶重悬,使细胞悬液的浓度为 2E+7个细胞/ml(以2E+6/只接种量)；
（3）、准备好肿瘤细胞后(2E+7/mL),使用一次性胰岛注射器,吸取细胞悬液,肺原位注射。每只100ul；
（4）、每周一次在活体成像仪下观察成瘤情况:按 10μl/g 的量腹腔注射D-Luciferin(15mg/mL),过 15分钟以后,使用活体成像仪器自带气体麻醉系统进行异氟烷气体麻醉,然后将 其放置于活体成像仪下进行成像,观察荧光,保存数据；
（5）、根据不同肿瘤细胞原位成瘤能力强弱不同适时结束实验,结束前对小鼠进行活体成像,方法同上。成像结束后,对实验动物进行注射过量2%液体麻醉剂(0.5mL)安乐致死,待其完全昏迷再进行颈椎脱臵确认死亡；
（6）、用医用剪刀和医用镊子解剖动物,观察其肺部及瘤体组织;使用游标卡尺测量瘤体长宽,计算肿瘤体积;使用精密天平称取瘤体及肺重量；
（7）、根据活体成像结果观察肝脏、淋巴、脾脏等其他器官组织,看是否有出现转移灶; 并取下进行观察；
（8）、将取出的肺、瘤体等器官组织,按照客户要求,放于4%多聚甲醛固定常温保存或液氮冷冻后-80°保存,以备送样。
小鼠实验肿瘤动物模型构建关键要细心，尤其是肿瘤细胞选择，肿瘤组织块处理上要仔细认真，这是影响模型成功建立的关键，还有移植手术时更要耐心细致，不要还没有建立就已经失败。
注意事项
原位种植时应遵循严格的生物安全标准，避免细菌污染。
其他
原位种植法模拟肺癌发生的自然环境，是建立肺癌转移模型的最佳方法。肿瘤学研究中应用最多的皮下种植法建立的模型只是局部包块而无远处器官的转移和播散，不出现肿瘤相关症状。胸腔内原位种植法操作简便，重现临床NSCLC转移过程；GFP转入人肺腺癌A549细胞对生长活性和致瘤性无影响，A549/GFP用于NSCLC转移模型结果可靠；借助于荧光显像设备，利用GFP的示踪功能可以非侵人性检测NSCLC转移。