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想验证miRNA与靶基因的作用? –双萤光素酶报告基因检测
想了解miRNA和lncRNA/circRNA的靶向互作?–双萤光素酶报告基因检测
想知道转录因子对下游基因的作用? –双萤光素酶报告基因检测
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1双萤光素酶报告系统介绍

Dual-Luciferase®双萤光素酶报告基因检测系统:在细胞中同时表达萤火虫萤光素酶(Firefly Luciferase简称F-Luc)和海肾萤光素酶(Renilla Luciferase简称R-Luc),其中F-Luc作为报告基因反应目的基因表达的改变,R-Luc作为内参基因,为实验提供统一基准线(减少内在变化因素如培养细胞的数目,细胞转染和裂解的效率对实验准确性的影响)。所构成的报告系统广泛用于基因调控、非编码RNA靶向互作等研究领域。 

F-Luc表达框的上游启动子区域插入不同功能序列,通过转录起始条件改变造成其报告萤光的变化。F-Luc的3’UTR区域替换成靶基因的3’UTR,过表达microRNA(降解mRNA或者翻译抑制),可以反映是否存在靶向互作。

2 应用介绍
2.1

miRNA靶基因验证

实验原理

miRNA主要通过作用于靶基因的3’UTR起作用(降解或抑制翻译),将目的基因3’UTR(野生型和结合位点突变型)序列构建至载体中报告基因F-Luc的3’端,通过比较过表达miRNA后,报告基因表达的改变(萤光素酶的活性下降还是不变),来确定miRNA与靶基因3’UTR的作用位点。

案列介绍

题目: Tumor-derived exosomal miR-1247-3p induces cancer-associated fibroblast activation to foster lung metastasis of liver cancer

期刊: Nature Communications

小结:验证B4GALT3(β-1,4-半乳糖基转移酶III)基因具有miR-1247-3p的靶向结合位点。将B4GALT3预测结合位点的序列克隆到报告基因载体,同时构建靶位点突变的载体,分别共转miR-1247-3p mimics及NC mimics,结果显示转染miR-1247-3p 的WT组相对荧光值降低,MUT组不变,提示存在靶向结合。

  Tian Fang et al.,Nature communications2018

相关实验:miRNA同lncRNA/circRNA靶向互作

2.2

启动子活性验证

实验原理

转录因子主要通过作用于靶基因的启动子起作用,将目的基因启动子区序列替换报告基因F-Luc的启动子,通过共表达转录因子后,报告基因表达的改变,来确定转录因子与靶基因启动子结合位点及对靶基因的作用。

案列介绍

题目:Invasion of white matter tracts by glioma stem cells is regulated by a NOTCH1-SOX2 positive-feedback loop

期刊:Nature Neuroscience

小结:验证Sox9在Sox2启动子区有多个结合位点,构建不同的启动子片段到报告基因载体中,共表达Sox9,显示插入片段的缩短和推测结合位点的减少,荧光素酶活性也随之下调。

Jun Wang et al.,Nature neuroscience,2018

3 技术路线

根据实验目的设计实验方案—预测结合位点–构建野生/突变报告基因载体系统—共转染细胞—检测酶活

常用靶基因结合位点预测网址:

http://www.targetscan.org/

http://genie.weizmann.ac.il/pubs/mir07/mir07_dyn_data.html

http://www.mirbase.org/

常用转录因子结合位点预测网址:

http://jaspardev.genereg.net/

http://www.genomatix.de/

http://alggen.lsi.upc.es

实验步骤

主要分为:质粒构建→质粒转染细胞→双报告基因检测→统计学分析。

 质粒转染细胞:  

1、细胞铺板:将细胞按70%的汇合度接种到96孔板。

2、转染:16小时后转染萤光素酶报告基因质粒和RNA,每个样品设置6个复孔。

1) 配制DNA和转染试剂: 96孔板转染质粒时每孔比例Firefly:Renilla:转染试剂=0.1μg:0.01μg:0.25μl;

2) 配制RNA和转染试剂稀释液,RNA的终浓度为100nM,转染试 剂每孔0.25μL;

3) 稀释好的DNA和RNA及转染试剂,常温孵育5min;

4) 将稀释好的DNA和RNA分别和转染试剂混匀,常温孵育20min;

5) 每孔弃去50ul培养基,将25μL DNA转染混合液和25uL RNA转 染混合液分别添加到每孔细胞样品中;

6) 转染6小时后,换新鲜完全培养基。

 双报告基因检测:

1、质粒共转染48小时后,弃去培养基,用100μl 1XPBS洗1遍;

2、 倾斜96孔板,吸干剩余的PBS;

3、去离子水将5XPLB稀释成1XPLB,使用前放到常温;

4、每孔加50μl稀释好的 1X PLB,摇床常温条件下摇15min,进行裂 解;

5、白色不透光的96孔酶标板中每孔加步骤4的上清液10μl, 加入100 μl预先混好的LAR II,2s后测数据;

6、每孔添加100μl预先混好的Stop&Glo Reagent,静止2s后,测数 据  注意:进行Luciferase活性检测时,需在避光条件下进行。

 统计学分析

4常见应用方向总结

(1)验证miRNA同mRNA靶向互作。将靶mRNA的3’UTR序列插入报告基因载体,再共转入该miRNA,如果萤光素酶活性下降,则提示为其靶序列。 

(2) 验证miRNA同circRNA靶向互作。将circRNA序列插入报告基因载体中F-Luc的3’UTR区域,检测萤光素酶活性。 

(3) 验证miRNA同lncRNA靶向互作。将lncRNA序列插入报告基因载体中F-Luc的3’UTR区域,检测萤光素酶活性。

(4)启动子活性分析。将启动子区域序列进行分段截短,再分别构建入报告基因载体,检测其启动子活性。

(5) 验证特定转录因子同启动子的作用。将启动子区域插入报告基因载体,同时在实验细胞中共转该转录因子,分析转录因子过表达是否提高萤光素酶活性。 

(6)分析信号通路是否激活。将该信号通路的下游响应原件序列构建入报告基因载体,在不同上游信号条件下,萤光素酶活性代表了通路的下游响应。

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