有过 qPCR 实验经验的研究者可能很快就能熟悉其不同于 PCR 的结果Ct 值， 以及数据的常用运算方法比较 Ct 方法（2 -△△Ct ）。 那么这个数据到底有没有统计意义呢？ 这个该如何分析？ 我们来逐渐了解相对定量 qPCR 的数据统计分析。

    首先在数据分析之前， 要确保数据的准确性， 也就是实验过程的各个部门都要严格操作， 也就是 MIQE 标准（具体可见 Bustin SA et al Clin Chem 55,61 1 -622 2009）。 这些都做到了， 那么就可以来分析 Ct 数据了。统计分析， 至少有 3 个数据才可以。 那就是在设计实验中， 每组至少要有 3 个生物学重复（也就是 3 个不同的样本）。这个和 qPCR 的 3 个 PCR replicate 是完全不同的概念（这儿是同一个样本的 3 个重复）。

    下面我们就以一个处理分析的实验来做说明如何来数据统计分析。 1 个处理组和 1 个对照组， 每组有 3 个样本（也就是生物学重复）， 来检测某目的基因（target， 设定内参基因为 reference）， 在这个处理中， 目的基因的表达是否受到抑制？ 同时这个抑制作用是否有统计学意义。

    不管是哪个 qPCR 仪， 都可以做此检测， 数据也都可以用 excel 表归纳如下：

    首先每个样品的目的基因和内参基因的 3 个 PCR replicate 要求出平均值， 这个仅仅是技术重复，也就是确定这个数据是可靠的。然后求出在每个样品的目的基因的变化量也就是（目的基因的量和其对应的内参基因的量相比， 也就是 2^-△Ct ）。 然后再平均对照组中的 3 个 2^-△Ct ， 在此例子中数据为 0.006482， 然后所有 2^-△Ct的都和 0.006482 相比即可到 2^-△△Ct ，也就是倍数变化（fold change 或者 relative expression）。

    下面就可以对 2^-△△Ct 或者 2^-△Ct 或者就行统计分析， Ct 的 2 种形式都可以进行统计分析， 唯独不能对 Ct 进行统计分析。 具体统计分析的方法， 任何统计分析软件都可以用比如SPSS， GraphPad 等。 这里展示一下 GraphPad 分析的结果。

Demo data下载：Demo data

进哥最近整理一些小程序，将qPCR计算+统计分析也实现了自动化分析：

Jingle’s shinyapps toolkit