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要了解同源双交换必须掌握同源重组,因为同源双交换就是进行了两次同源重组。

概念:同源重组是指两个DNA分子之间拥有相同/相似碱基顺序的片段(同源序列/同源性较高的序列)位置发生序列交换,同源重组依赖于序列的同源性。

!!!注意两点: ① 同源性和特异性是两个不同概念;② 交换发生在序列相同或相似的具体位置,而非两个DNA分子之间全部交换。

发生同源重组的几个条件

1. 重组交换区含有相同或相似的碱基序列;

2. 两个分子之间要相互靠近,发生联会,之后发生互补配对;

3.需要重组酶催化,体内通常不需要另外添加,体外重组要加重组酶。

体内同源重组自然发生,只要了解意思就行;体外同源重组,很多公司都有重组酶卖的,什么一步克隆、无缝克隆大多是利用重组酶进行克隆,难就难在引物设计(以后再讲)。目前解释同源重组的模型有三种:Holiday模型、单链断裂模型、双链断裂模型,我们只要知道序列相同和相似位置发生交换即可。(这几个模型也好理解,需要了解的同学自己去查)

这里主要解析同源双交换,毕竟很多学生硕士毕业甚至都没太搞懂。


同源双交换敲除实验详细解析:

1. 基因上下游同源臂设计(也有实验室叫基因外部同源臂、基因左右同源臂、F端/R端同源臂)

在待敲除基因上下游分别选取一段150-500bp左右的片段,以其作为上下游同源臂模板进行引物设计。上游同源臂正向和反向引物可命名为LF和LR,下游同源臂正向和反向引物可命名为RF和RR。(一共4条引物)在LF的5’加上载体双酶切时的一个酶切位点,在RR的5’端载入体双酶切时另一个酶切位点,在LR和RF的5’端分别加上相同的酶切位点(由你自己设计)。(至于保护碱基和具体怎么选酶,先自己学习一下,或者等以后的帖)

同源重组 同源臂

2. 普通PCR将片段扩增出来

以宿主DNA为模板,分别以LF/LR(一组)和RF/RR(一组)进行PCR扩增,之后纯化,酶切(将模板也进行酶切),再纯化,连接。

3. 将连接产物转化进大肠杆菌中

将连接产物转入感受态中,抗生素筛选,送测序。将测序成功的克隆进行培养,提取质粒。

同源重组 同源臂

4. 质粒转化/转染

真核生物里一般叫转染,可以化转也可以电转;在原核生物中一般称为转化,可以化转也可以电转,还有一些病原菌可以进行三亲本结合进行接合。

5.质粒与宿主DNA发生联会

同源重组 同源臂

6. 第一次筛选(重组)

如果用我示意图的载体,选用Amp抗生素进行筛选,筛选出发生了一次重组的中间体。注意碱基序列方向。

同源重组 同源臂

7. 第二次筛选(重组)

在培养基中加入蔗糖,蔗糖存在情况下,存在sacB基因的宿主会致死(自杀),在这样的压力下,发生第二次重组,未发生第二次重组的中间体死亡。就可以得到敲除基因的克隆。

同源重组 同源臂

图析:

说明:

1.第一次重组并非一定先发生在L臂,L/R臂都有可能,但是谁先谁后不影响两次重组后的结果;

2.部分宿主内,每次重组并非都是全部交换,而是随机的,具体看宿主本身的重组酶类型,但无论如何交换都不影响敲除效果,只影响敲除后L臂和R臂剩余多少在宿主中,如下图展示L臂部分重组;

同源重组 同源臂

3.部分宿主配合部分载体可以一次筛选出敲除单克隆,但其还是发生过两次重组,才能得到敲除基因片段的单克隆(必须一次次交换才有意义,只不过在第一次筛选是抗生素直接加两种,但不是sacB类载体)。

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