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CRISPR-Cas9系统是目前最流行的基因组编辑技术,可以实现目的基因的敲除、插入和突变,该技术是一种由RNA指导Cas蛋白对靶基因定性修饰技术。科学家为了让Cas蛋白定向剪切DNA序列,在CRISPR工作机理的基础上,人为重组了一段目的基因的sgRNA(small-guide RNA),在sgRNA的引导下,Cas9蛋白可以实现对目的基因的定向切割。本文主要介绍,目的基因sgRNA设计和如何将sgRNA构建到CRISPR-Cas相关载体。

 

1. 目的基因sgRNA设计

目前设计sgRNA的网站比较多,张锋老师实验组总结了sgRNA设计工具如:https://zlab.bio/guide-design-resources,其中synthego(https://www.synthego.com/products/bioinformatics/crispr-design-tool)是小编比较喜欢用的设计工具。不过该网站只能设计人、果蝇和小鼠基因的sgRNA。以人的基因TP53为例,介绍TP53基因sgRNA的设计过程。

1.1 打开synthego网站sgRNA设计工具,点击Launch Design Tool

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1.2 选择种属人Homo sapiens,人的TP53基因的ID号为7157,选择TP53基因,点击search;

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1.3 搜索结果分两部分:推荐的sgRNA和所有的sgRNA。往下滚动滚轮,会看到四条推荐的sgRNA的序列。

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1.4 点击其中一条sgRNA序列,会看到sgRNA在TP53基因上的具体作用位置;

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2. sgRNA重组构建

以lentiCRISPRv2载体为例,说明sgRNA是如果构建到该载体中。首先,将设计好的sgRNA中的U碱基改成T碱基,如TP53基因的sgRNA序列为5’-CAUUGCUUGGGACGGCAAGG-3’,修改后的碱基为5’-CATTGCTTGGGACGGCAAGG-3’,该序列的反向互补序列为3’-GTAACGAACCCTGCCGTTCC-5’。正向序列和反向互补序列退火成双链后就可以连接到载体中,但是需要在序列两端添加BsmBI酶切后的同源序列,如下图所示:

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在生工生物合成这两条互补的序列后,退火成双链就可以连接到用BsmBI酶切后的LentiCRISPRv2载体中。sgRNA载体构建具体的操作过程如下。

2.1 LentiCRISPR载体酶切和去磷酸化,用BsmBI在37℃酶切30min;

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2.2 琼脂糖凝胶纯化酶切的LentiCRISPRv2载体

LentiCRISPR载体的大小为14,873bp,酶切后产生两个片段,一条大的为目的片段,小片段大小为1885bp。在LentiCRISPRv2载体中有两个BsmBI酶切位点,两个位点之间的片段为1885bp,酶切连接后sgRNA正好在U6启动子下游,连接后的sgRNA下游就是gRNA scaffold序列,与sgRNA一起转录出来发挥gRNA的引导功能。

2.3 磷酸化和Oligo退火成双链DNA;

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反应条件如下:37℃  30min → 95℃  5min,然后按照5℃/min降温到25℃。

生工生物可以提供磷酸化修饰的引物,可以选择在Oligo的5’磷酸化修饰,就不需要用T4 PNK磷酸化Oligo链了。

2.4 稀释退火的Oligo链;

上一步退火后的双链DNA,按照1:200用水稀释。

2.5 双链Oligo与酶切的载体连接(室温连接10min)

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2.6 转化到Stbl3细菌;进行后续筛选。

17 Replies to “CRISPR-Cas9 sgRNA设计和载体构建”

  1. 你好,想问一下利用CRISPR cas 技术切割后,接下来怎么构建HMEJ同源重组载体,求老师指点,感恩!

  2. 你好,请问连接的是四敲载体,T0代检测其中一个靶点未被编辑,后面三个靶点有被编辑的可能吗?

    1. 你好,不清楚你具体怎么构建的,拼装到一个载体上的话 四敲有各自的guide RNA和转录原件的话互不影响;单独四个载体的话也不会相互影响。多位点敲除我没有具体实施过,希望有机会可以继续探讨

      1. 感谢回答,我还有一个问题,靶点靠近终止子,而且这个靶点成功靶向,那么这个基因靶序列前面是照常翻译的,只在靠近终止子附近提前终止,这个结果算是被成功编辑吗?与靠近启动子的靶序列在结果上会有偏差吗?希望得到你的回复,谢谢

        1. 如果编辑成功,也是在终止子附近发生碱基随机缺失,这就有很多种可能性,缺失3的倍数的碱基就少相应的氨基酸,还是到原来的终止子位置停止;如果不是,就是移码突变,有可能提前终止 也有可能延后。
          如你所说,终止子附近的突变可能对蛋白功能影响比较小,甚至没有影响,与你蛋白功能结构域相关。
          如果启动子,一旦移码突变,蛋白完全改变。
          so,你理解一下,尽量往上游设计

  3. 你好! 前辈,我想问一下,构建敲除载体,转化DH5a,菌P的条带很亮,但是送测得时候,没信号是什么原因呢? 我应该怎样调整一下呢?

  4. 你好,请问下最近在做一个基因的CRISPR,目标基因长度在7k左右,有两个cds区,分别位于基因的前端与尾端附近,且这两个cds分别位于两个可变剪切上,但不清楚基因的功能到底是哪个cds发挥作用、共同作用或者都具有作用(有其他文献报道cds2突变会导致功能改变,但两个蛋白序列具有一定的差异)。在进行双靶或多靶crispr载体构建时(promoter-sgRNA1-promoter-sgRNA2-promoter-Cas9),若靶点只作用在cds1区域,会不会使cds2进行突变呢?

    1. 你好,你是在疑问设计了靶向其中一个CDS的gRNA,会不会影响另外一个吗?你设计的位点是基因的promotor区?如果这样的话,势必两个都会有影响,敲除影响的是整个基因的转录。
      如果你是要分别研究两个CDS,可以分别在两个CDS靠近5‘端的位置设计gRNA。
      另外您做双靶点切除是如何做?promoter-sgRNA1-promoter-sgRNA2-promoter-Cas9,我不太明白,我所知道的是如果连个sgRNA不在一个质粒上,那就是同时转染两个质粒,如果要在一个载体上,需要两个sgRNA分别有各自的promotor和cas9。
      当然可能是我知识有限,还望可以一起讨论

  5. 您好,请问 如果设计的GRNA oligo是原目的基因的reverse端,那还是在forward端加CACC吗,还是应该以oligo 5‘端加cacc,互补链加 AAAC?拜托了

    1. 您好,sgRNA敲除载体构建时两端添加的是BsmBI酶切后的同源序列,目的是将oligo插入酶切后载体,与其位置无关。不管oligo target的位置是在正义链或反义链,都是一样在oligo的5’端添加

  6. 您好,最近在准备做CRISPR,想问一下前辈,连接之后做转化是必须用Stbl3感受态吗?可以用DH5α或者是TOP10吗?

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