01 

手动计数

手动计数有两种方式，一种是单类计数，适用于同一类型的细胞或菌落或者其他需要计数的物体；另外一种是分类计数，图片上明显有多类物体需要分类计数，比如混在一起的多种细胞。

单类计数很简单，利用Image J的Multi-point Tool（多点工具）手动点击即可，Photoshop的计数工具也能干这活儿。

1、File-Open Samples-Blobs，打开Image J自带例图；

2、在Point Tool（单点工具）上右键单击，然后在下拉菜单中选择Multi-point Tool（多点工具）；

3、在需要计数的细胞上面点击，即可生成一个标记和一个数字，数字表示当前点是第几个；

4、你并不需要时刻关注点下去是第几个点，也不需要按顺序点击；点完之后双击Multi-point Tool（多点工具）即可看到计数结果，下图红框处表示该类计数为20次；

如果要计数的物体有多类就要使用分类计数，多点工具也提供了分类计数的方式；

上图中的“20”上方的“Counter”其实就是一个分类计数器，表示分类为0的计数为20，也就是图中黄色标签有20个；我们把0切换到1，然后继续点击，计数标签为紫色，表示的就是另一类物体的计数了，如下图所示；

计数器可以切换回“0”，所以在多类计数之后，可以切换查看各类计数的数目。

重点：多点工具如果点错了，要删除之前的同类型下的点，可以按住Alt键，同时单击要删除的点。

另外一种方法是使用Cell Counter插件。

1、点击Plugins–Analyze–Cell Counter-Cell Counter，打开该插件；

2、点击Initialize初始化计数器，单击选择一个计数器（下图为Type1），然后使用多点工具进行点击计数，在Type 1右边会实时显示计数结果；计完一类，点击另一个计数器（Type 2或其他），同样操作，可以进行下一类计数；

右边还可以Add、Remove或Rename计数器（Counter）；Delete表示依次删除之前一个计数点，如果要删除很久之前记录的计数点，可以勾选Delete Mode并且选中相应的计数器（Counter），想删该类中哪个就左键单击哪个；

 

02

常规自动计数

自动计数首先要获得能够用于自动计数的选区，然后再来统计选区数量，所以自动计数的关键在于如何准确地自动获得选区。准确获得选区的方法就多了去了，每一种都能逼格十足，然而本文不讲……下次有时间再写另外一篇或几篇推文。

1、打开图片之后，Image-Type- 8-bit，改为灰度图像，便于后面的利用阈值来自动形成选区；

这一步之后可以反向（Edite-Invert）、可以调节对比度（Image-Adjust-Brightness/Contrast）、可以提高对比度（Process-Enhance Contrast）……甚至可以在打开图像之后就将图像转变为HSB模式（一种和RGB、CMYK等并列的颜色模式），选择其中一个对比度比较大的通道（一般是亮度（Brightness）通道）进行复制，然后用于计数。这些辅助步骤都是为了使得被计数对象能够与背景区分更加明显，所以你在不同的教程里面会看到略有差异，当然如果比对明显，也可以什么都不做，比如本文用的例图就什么都不需要做~~

2、Image-Adjust-Threshold，调节阈值（Threshold），默认采用红色蒙版代表选区，当然你也可以修改，但是没必要。由于待测物体的颜色（灰阶值）相差很小，却与背景的灰阶值存在显著差异，通过所谓的阈值（Threshold）就可以设定待测物体灰阶值的上下限，来批量、自动地界定待测物体的选区。所以，如果待测物体与背景值灰阶值区分不大，或者待测对象灰阶值不均匀，则不能通过这种方法来进行自动选取。

下图红框左边表示能够自动识别选区的方法，一般使用Default（默认），右边表示蒙版的颜色或形式，默认红色就挺好；至于下面几个参数基本也用不到，默认就好；

默认的各种选区识别方法参数可能不尽人意，你可以使用上面两个滑块调节灰阶范围，同时观察图片中红色蒙版覆盖的物体，尽量将你需要计数的物体都盖进去，

3、点击Apply；会自动对图像进行二值化（Binary，简单地说是让图片“非黑即白”）处理，便于下一步统计；

4、有些细胞连在一起了，所以要把它们分开，计数成两个细胞；image J本身提供一个所谓的“分水岭（Watershed）”法来分割细胞连接，Process-Binary-Watershed；这种方法对于规则细胞或规则物体是比较适用的，如果待计数物体不规则，就很容易出现分割错误。

下图白色分割线就是这个方法产生的效果。

5、点击Analyze-Analyze Particles，弹出如下界面；

左边三个框都勾选，分别表示展示分析结果、清除上一次分析的结果、以及本次结果的Summarize；如果在后续的分析中不需要用到刚刚采用阈值（Threshold）自动形成的选区，左边第四个框也不用勾选；右边第一个框表示排除边缘物体，也就是边缘的半个细胞要不要计数；右边第二个表示允许包括洞，为什么会有洞呢？如果待测物体灰阶值不均匀，比如某物体边缘黑中间白，那么就会形成一个洞，这个洞很显然不能算一个计数，可以勾选该选项去除。也有人会在第3步和第4步之间添加一个补洞步骤：Process-Binary-Fill Holes，这里没洞，就没做了。

最重要的是最上面可以通过Size（大小）和Circularity（圆度）来对要计数的对象进行筛除，比如本例图中有一些小黑点明显不是细胞，那么可以通过设定Size的下限来排除。

那如何获得正常细胞大小或者圆度的区间呢？一般是通过Wand Tool（魔棒工具）来选择并实际测量几个正常细胞，估计一下区间，然后把上下限值填入最上面的两个选框中。（关于魔棒工具等基本工具以及测量工具本来想先写一些推文的，一打开软件就忘了，先写了计数这篇，以后补上）。

下面的Show是结果展示形式，一般选择“Outline”就行，其他效果有兴趣的自己试一下。

6、最后会获得三个结果：

• Outline结果图，每个细胞有轮廓有计数；

• 详细的Results列表；

• Summary，从Summary可以看到计数结果（Count）为52，还有其他一些统计量。