有过 qPCR 实验经验的研究者可能很快就能熟悉其不同于 PCR 的结果Ct 值, 以及数据的常用运算方法比较 Ct 方法(2 -△△Ct )。 那么这个数据到底有没有统计意义呢? 这个该如何分析? 我们来逐渐了解相对定量 qPCR 的数据统计分析。
首先在数据分析之前, 要确保数据的准确性, 也就是实验过程的各个部门都要严格操作, 也就是 MIQE 标准(具体可见 Bustin SA et al Clin Chem 55,61 1 -622 2009)。 这些都做到了, 那么就可以来分析 Ct 数据了。统计分析, 至少有 3 个数据才可以。 那就是在设计实验中, 每组至少要有 3 个生物学重复(也就是 3 个不同的样本)。这个和 qPCR 的 3 个 PCR replicate 是完全不同的概念(这儿是同一个样本的 3 个重复)。
下面我们就以一个处理分析的实验来做说明如何来数据统计分析。 1 个处理组和 1 个对照组, 每组有 3 个样本(也就是生物学重复), 来检测某目的基因(target, 设定内参基因为 reference), 在这个处理中, 目的基因的表达是否受到抑制? 同时这个抑制作用是否有统计学意义。
不管是哪个 qPCR 仪, 都可以做此检测, 数据也都可以用 excel 表归纳如下:
首先每个样品的目的基因和内参基因的 3 个 PCR replicate 要求出平均值, 这个仅仅是技术重复,也就是确定这个数据是可靠的。然后求出在每个样品的目的基因的变化量也就是(目的基因的量和其对应的内参基因的量相比, 也就是 2-△Ct )。 然后再平均对照组中的 3 个 2-△Ct , 在此例子中数据为 0.006482, 然后所有 2-△Ct的都和 0.006482 相比即可到 2-△△Ct ,也就是倍数变化(fold change 或者 relative expression)。
下面就可以对 2-△△Ct 或者 2-△Ct 或者就行统计分析, Ct 的 2 种形式都可以进行统计分析, 唯独不能对 Ct 进行统计分析。 具体统计分析的方法, 任何统计分析软件都可以用比如SPSS, GraphPad 等。 这里展示一下 GraphPad 分析的结果。
Demo data下载:Demo data
进哥最近整理一些小程序,将qPCR计算+统计分析也实现了自动化分析:

你好,看了你的demo,发现你的计算方法有问题的,虽然原理是对的,但是你先求2-△Ct 再求2-△△Ct
,和先求ΔΔct,再求2-△△Ct的结果是不一样的,标准的方法还是先求ΔΔct。感觉如果扩增效率达不到2的时候,你的这种算法,还会进一步增大误差。
您好,qPCR示例表格中的TRT是下机数据的哪部分啊?
你好,请问我做了三个生物重复,但是计算重复只做了一个,我在计算的时候是每个生物重复各算各的还是要把这三个生物重复放在一起算呢,我试了一下各算各的和三个生物重复合在一起算结果完全相反
老师,在计算平均值的时候,使用算数平均值还是几何平均值?
感谢分享,非常实用!!
TRT的数据组分析2-△△Ct好像引用了CON组的2-△Ct
刚刚开始学这个。不知道是不是自己理解错了。还请大神有时间的话看看。
这个网站好棒!
只是网页背景就玩了好久哈哈,太牛了
哈哈哈哈哈哈哈我也是,在页面一直玩
进哥哥你这的检验是t吗?