免疫荧光染色是研究特异蛋白抗原在细胞内分布的一种常用实验技术，通过荧光素所发的荧光可在荧光显微镜下对抗原进行细胞定位。通常我们可以对免疫荧光图片进行半定量分析，也就是计算平均荧光强度，其实就是测量灰度值。

注意：对于包括免疫荧光免疫组化在内的所有需要进行半定量分析的图像，一定要控制原始图像的质量，同一实验要在同一个参数下进行图片采集。

对于一张单通道（单色）的荧光图片，每个像素的灰度值代表了该点的荧光强度大小，特定区域的荧光强度公式：

平均荧光强度(Mean) = 该区域荧光强度总和(IntDen) / 该区域面积(Area)

Mean: Mean gray value

IntDen: Integrated Density

注意：平均荧光强度并不等于免疫组化中的光密度（Optical Density），所以不需要Invert以及Calibration。

接下来以一个ROS荧光显微镜的图片为例进行演示：

1. 打开图片

2. 转换为灰度图片

Image🡪 Type 🡪 8-bit

3. 调整Threshold选中所有细胞区域

Image 🡪 Ajust 🡪 Threshold

如图两个圈出来的区域都是可以进行调整，以尽量选中细胞区域而不选中背景。

4. 设置需要计算的参数

Analysis 🡪 Set measurement 🡪 如下图勾选这几个选项

5. Measure

Analysis 🡪 Measure

Mean即为平均荧光强度。（Mean即Mean gray value，等于IntDen/Area），IntDen=Integrated Density（荧光强度总和）

需要批量操作的话，参考：

Image J脚本批量定量免疫组化图片

主体代码需要修改，threshold值根据大家啊各自情况进行设置：

dir=getDirectory("Select the source directory");
list=getFileList(dir);
Array.sort(list);

for(i=0;i<list.length;i++){
	filename=dir+list[i];
	if(endsWith(filename,"tif")){
		open(filename);
		run("8-bit");
                                setAutoThreshold("Default dark");
		//run("Threshold...");
		setThreshold(19, 255);	//设置Threshold选出所有包含细胞的区域
		run("Measure");  
		run("Close");	//关闭图片窗口
	}
}

运行：Plugins –> Macros –> Run –> 选择脚本