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01 
手动计数

手动计数有两种方式,一种是单类计数,适用于同一类型的细胞或菌落或者其他需要计数的物体;另外一种是分类计数,图片上明显有多类物体需要分类计数,比如混在一起的多种细胞。

单类计数很简单,利用Image J的Multi-point Tool(多点工具)手动点击即可,Photoshop的计数工具也能干这活儿。

1、File-Open Samples-Blobs,打开Image J自带例图;

2、在Point Tool(单点工具)上右键单击,然后在下拉菜单中选择Multi-point Tool(多点工具);

3、在需要计数的细胞上面点击,即可生成一个标记和一个数字,数字表示当前点是第几个;

4、你并不需要时刻关注点下去是第几个点,也不需要按顺序点击;点完之后双击Multi-point Tool(多点工具)即可看到计数结果,下图红框处表示该类计数为20次;

如果要计数的物体有多类就要使用分类计数,多点工具也提供了分类计数的方式
上图中的“20”上方的“Counter”其实就是一个分类计数器,表示分类为0的计数为20,也就是图中黄色标签有20个;我们把0切换到1,然后继续点击,计数标签为紫色,表示的就是另一类物体的计数了,如下图所示;

计数器可以切换回“0”,所以在多类计数之后,可以切换查看各类计数的数目。

重点:多点工具如果点错了,要删除之前的同类型下的点,可以按住Alt键,同时单击要删除的点。

另外一种方法是使用Cell Counter插件
1、点击PluginsAnalyzeCell Counter-Cell Counter,打开该插件;
2、点击Initialize初始化计数器,单击选择一个计数器(下图为Type1),然后使用多点工具进行点击计数,在Type 1右边会实时显示计数结果;计完一类,点击另一个计数器(Type 2或其他),同样操作,可以进行下一类计数;
右边还可以Add、Remove或Rename计数器(Counter);Delete表示依次删除之前一个计数点,如果要删除很久之前记录的计数点,可以勾选Delete Mode并且选中相应的计数器(Counter),想删该类中哪个就左键单击哪个;

 
02
常规自动计数
自动计数首先要获得能够用于自动计数的选区,然后再来统计选区数量,所以自动计数的关键在于如何准确地自动获得选区。准确获得选区的方法就多了去了,每一种都能逼格十足,然而本文不讲……下次有时间再写另外一篇或几篇推文。
1、打开图片之后,Image-Type- 8-bit,改为灰度图像,便于后面的利用阈值来自动形成选区;

这一步之后可以反向(Edite-Invert)、可以调节对比度(Image-Adjust-Brightness/Contrast)、可以提高对比度(Process-Enhance Contrast)……甚至可以在打开图像之后就将图像转变为HSB模式(一种和RGB、CMYK等并列的颜色模式),选择其中一个对比度比较大的通道(一般是亮度(Brightness)通道)进行复制,然后用于计数。这些辅助步骤都是为了使得被计数对象能够与背景区分更加明显,所以你在不同的教程里面会看到略有差异,当然如果比对明显,也可以什么都不做,比如本文用的例图就什么都不需要做~~

2、Image-Adjust-Threshold,调节阈值(Threshold),默认采用红色蒙版代表选区,当然你也可以修改,但是没必要。由于待测物体的颜色(灰阶值)相差很小,却与背景的灰阶值存在显著差异,通过所谓的阈值(Threshold)就可以设定待测物体灰阶值的上下限,来批量、自动地界定待测物体的选区。所以,如果待测物体与背景值灰阶值区分不大,或者待测对象灰阶值不均匀,则不能通过这种方法来进行自动选取。

下图红框左边表示能够自动识别选区的方法,一般使用Default(默认),右边表示蒙版的颜色或形式,默认红色就挺好;至于下面几个参数基本也用不到,默认就好;

默认的各种选区识别方法参数可能不尽人意,你可以使用上面两个滑块调节灰阶范围,同时观察图片中红色蒙版覆盖的物体,尽量将你需要计数的物体都盖进去,

3、点击Apply;会自动对图像进行二值化(Binary,简单地说是让图片“非黑即白”)处理,便于下一步统计;

4、有些细胞连在一起了,所以要把它们分开,计数成两个细胞;image J本身提供一个所谓的“分水岭(Watershed)”法来分割细胞连接,Process-Binary-Watershed;这种方法对于规则细胞或规则物体是比较适用的,如果待计数物体不规则,就很容易出现分割错误。

下图白色分割线就是这个方法产生的效果。

5、点击Analyze-Analyze Particles,弹出如下界面;
左边三个框都勾选,分别表示展示分析结果、清除上一次分析的结果、以及本次结果的Summarize;如果在后续的分析中不需要用到刚刚采用阈值(Threshold)自动形成的选区,左边第四个框也不用勾选;右边第一个框表示排除边缘物体,也就是边缘的半个细胞要不要计数;右边第二个表示允许包括洞,为什么会有洞呢?如果待测物体灰阶值不均匀,比如某物体边缘黑中间白,那么就会形成一个洞,这个洞很显然不能算一个计数,可以勾选该选项去除。也有人会在第3步和第4步之间添加一个补洞步骤:Process-Binary-Fill Holes,这里没洞,就没做了。
最重要的是最上面可以通过Size(大小)Circularity(圆度)来对要计数的对象进行筛除,比如本例图中有一些小黑点明显不是细胞,那么可以通过设定Size的下限来排除。
那如何获得正常细胞大小或者圆度的区间呢?一般是通过Wand Tool(魔棒工具)来选择并实际测量几个正常细胞,估计一下区间,然后把上下限值填入最上面的两个选框中。(关于魔棒工具等基本工具以及测量工具本来想先写一些推文的,一打开软件就忘了,先写了计数这篇,以后补上)。
下面的Show是结果展示形式,一般选择“Outline”就行,其他效果有兴趣的自己试一下。
6、最后会获得三个结果:
  • Outline结果图,每个细胞有轮廓有计数;

  • 详细的Results列表;

  • Summary,从Summary可以看到计数结果(Count)为52,还有其他一些统计量。

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