感谢大家的支持，欢迎给我留言！

另外，也欢迎合作，包括实验（质粒构建，WB，流式细胞术以及常规毒理学实验等），网站制作，R语言分析绘图，视频制作等，都可。感兴趣可移步至我的简历，底部悬浮按钮可添加微信或邮件联系。

406 Replies to “给我留言”

  1. 查流式细胞术，不知怎么就进了你的个人网站，很是吃惊，从科研到爱情，真是慕了慕了，想咨询一下我跑大鼠海马组织的流式，需标记7个markers，因产品问题，做不到多色流式，只能一个一个的测，如何保证细胞数，是否需3只大鼠的平行实验，感觉工作量好大，非常感谢！

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    1. 你好，首先建议如果不能做多色流失，同时要检测这么多指标，而且这些指标都是独立的，建议用免疫组化，最主要你还是组织样本。如果流式，你就需要新鲜样本，而且还需要研磨或酶解制备单细胞，很麻烦，然后还有单色流式结果图不好看。而免疫组化完全可以解决这些问题。
      现在聊一聊你针对流式提的问题，细胞数目的话，如果你制备单细胞悬液的组织够多，细胞总量是足够，至于每个样本的细胞数，这个不需要过多考虑，因为流式可以设置上机收集细胞总数，一般10000个细胞。第二个3只大鼠平行，一般做动物实验，组内误差会比较大，一般要求每组动物数目至少5个，三个有点少，这个是生物学重复，至于检测重复，可以同一样本上两次机，看结果变异，判断是否可信；
      最后，祝实验顺利 有问题可以继续加微信讨论，我的简历里面有。
      再最后，对于你这种情况，不建议流式，建议IHC

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  2. 你好 读了您cas9引物设计的文章 收益良多 就是有个小问题 按照上面操作出来的前4条为什么不是出现在CDS区 是否sg引物不在CDS区也可以操作的 谢谢

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    1. 你好，选取一般是靠近上游 也就是5‘端，除了CDS区的位点 还可以选择启动子区域的，并不一定要CDS 只要能阻断其转录出功能性RNA即可

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  3. 半夜查文献和生信方法忽然误入您的个人网站，真的很佩服您对知识的体系性架构和对生活的热爱，爱情板块着实让我在深夜吃了一大口狗粮！！希望您可以保持更新，不仅是科研相关知识信息，还有您幸福的生活！这对我们这些科研小民工来说真的很有激励意义！

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  4. 感谢您的总结和分享，非常有帮助，希望您保持更新，向优秀的师兄看齐~

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  5. 您好，参考了您写的关于放线菌素D处理检测mRNA稳定性的实验，有个实验细节想请教一下。就是用来反转录的RNA的量必须是相同的吗？那用相同的1ugRNA去反转，然后后续做RT-PCR的时候，是每个反应的模板量也必须是一样的对吧？主要是我没太明白这个实验的不变量是什么？另外就是，这个需要加阴性对照吗？我看文章里有人用GAPDH作为阴性对照

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    1. 您好，和我之前的疑惑一样。解释一下：放线菌素D不是选择性 PolII 抑制剂，因此任何 RNA 的转录都会受到影响（包括 PolI 和 PolII 转录物），因此很难选择转录物进行标准化，包括你所说的文献中的GAPDH（讲道理任何RNA都不合适）。因此，只能控制RNA提取、逆转录的质量和总量，在这个方法中只对第一个数据点进行归一化以确定衰减率。出于这个原因，可以多几个独立实验（生物重复）。

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  6. 王老师，您好，您这边是否有NCI-H23和NCI-H522这两种细胞系，可否惠赠一些，谢谢！

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  7. 在应用http://crispr.mit.edu/该网站设计目标基因sgRNA时，网站给出许多结果，该如何挑选呢？ 是根据每条sgRNA的MIT和CFD等评分挑选吗？

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    1. http://crispr.mit.edu/这个网站不是关闭了吗？我比较喜欢的两款工具分别是：Synthego和Broad Institute GPP ，其它还有更多工具在张峰实验室提供的导航上有：https://zlab.bio/guide-design-resources
      对于如何选择，我也没有考虑太多，最主要就是位点尽量接近5’端，即翻译蛋白的N端，这样可以尽量可能的导致移码突变；
      对于Synthego，网站会给出top-ranked 4 sgRNAs，依据主要就是网站提供的敲除效率算法和脱靶效应，应该大多数情况下top4应该至少有一个可以，当然选择的时候还是尽量往基因上游找：CRISPR-Cas9 sgRNA设计和载体构建

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      1. 好的好的，谢谢。我先挑了几个sgRNA，看一下切割效率。
        我想再请教一个问题，关于PCR，我想通过ddPCR检测基因拷贝数变异和融合基因，这样的引物位置如何设计。

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        1. 你好 这个技术我是第一次听说 受教了，查了一下资料，大概了解了一下原理：应用微滴数字PCR技术测定植物中的转基因拷贝数 ——转自Bioprotocol
          这个技术只是在检测上有差异，将反应体系打散成很多个液滴，每个液滴里面单独进行反应，最终数据展示看起来有点像流式检测。至于前面的引物设计与普通PCR一样，找一段该目的基因的特异序列，用primer premiere5设计，没有什么其它特殊地方
          谢谢交流，又长知识了

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  8. 你好，我想请教一个问题，甲基化特异性PCR引物设计时，为什么上游引物与经过亚硫酸氢钠处理后的序列一致，而下游引物与经过亚硫酸氢钠处理后的序列互补？上游引物与什么互补？

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    1. 首先需要知道的是重亚硫酸盐处理之前基因组DNA是需要变性解链的，因此，经过处理之后得到的产物应该是单链。如你所说，上游引物是和转换之后的序列5‘相同，而下游引物则互补配对，可以想象1st PCR只是由下游引物发挥作用，向上合成互补链，得到双链DNA，往后的循环则是以第一轮产物为模板，上下游引物同时作用实现指数扩增。详见下文原理：
      MethPrimer：DNA甲基化PCR引物的设计

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  9. 你好，我是做酵母的，想找酵母基因里的5‘’UTR区，但NCBI和SGD等网站里的基因信息并没有给出UTR区或TSS，故想询问你一下是否知道有可以预测基因的UTR区的软件或网站吗？谢谢！

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    1. 酵母的不清楚诶，我再ensembl上查看也没有UTR，但是TSS一般选择的是基因的5‘侧翼序列2000左右，这个可以得到

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    1. GTEx联合TCGA数据库差异分析你好，这篇教程里有合并的教程，用于泛癌分析。如果只是一种癌症，直接下载TPM标准化的两个数据，筛选出你所感兴趣的癌症类型，直接合并分析就好。一定要是同一种标准化方式的才可以直接合并，比如都是TPM的数据

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  11. 进哥，请问保护碱基中标灰色和标红色的碱基什么区别，红色是必须要有灰色是可以不用的吗？

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    1. 你好，红色标红的是酶切位点识别序列，比如BamHI 它的序列是CGGGATCCCG
      其中GGATTC是识别序列，主体部分，两边的灰色碱基是保护碱基，在设计的时候如果不加保护碱基，可能酶切效率会比较低，具体加什么保护碱基或者加几个，就可以参考这个表，尽量保证较少保护碱基达到尽量高的酶切效率

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  12. 作为一名兽医小博士向您学习~受益匪浅~还望多多分享您的经验~

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  14. 你好，你这边有NCI-H522的细胞形态图吗？找了好几个网站都没有找到，有的话可以分享一下吗？谢谢了

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    1. 我也没有养过，查了几篇文献，其中有H522细胞形态图片，你看看，文章中还有荧光图也可参考： https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3628951
      https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6459861

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  15. 您好！我是一名在读硕士研究生，看到您的个站非常流畅有趣，我也想有一个这样的个人网站，请问怎么才能搭建一个如你这个一样的网站呢。

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    1. 您好，谢谢啦！网站搭建还是挺简单的 租域名和服务器或空间，像电脑传软件一样将网站程序装好，然后就是个性化布局，再然后就是坚持更新内容。单独就弄一个博客网站很简单，难就是内容，坚持。我是用的WordPress博客软件

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  16. 收获良多，有很多赞美的话和对进哥的祝福，文采不好就不献丑了，祝福进哥一家人生活幸福。

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  18. 不好意思 打扰到您 麻烦问一下您 primer 5的下载 打开您给的安装包以后 注册机下载好了后 primer premier 5.0v是要自己再下载一个吗？

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  19. 师兄，你这网站做的太好了，我的研究方向和你很相似，受益匪浅，最近在学习构建siRNA和过表达载体，引物设计成了难点，还请师兄赐教

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  20. 生物小白鼠路过，给您点个赞，感谢无私奉献，感谢分享点滴温暖！

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  21. 兄弟，我也是19级的博士，但我在郑州。看到你的成果，效率好高呀。有空多交流~

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  22. 师兄，你好，请问有没有什么实用一点的对新手讲文献汇报的建议啊，每个月文献汇报之前都好紧张！还有对文献中看不懂的图应该怎么办啊！感谢师兄！！！

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    1. 同学你好，关于文献汇报这个我也没有什么特别好的建议，一开始可能刚刚接触本方向相关文献，确实有许多不太明白的地方，建议可以关注几个自己方向相关的公众号。有些公众号会有文献精读，尤其是一些比较有分量的新发表的高分文章，可以从别人的总结中学习，也可以在别人讲解的基础上进一步总结，作为自己的汇报内容，有点偷懒，但是对于新手很有帮助。
      一篇文章要去学习，我觉得最主要的就是摘要，必须清楚这篇文献研究目的和结论，带着疑问取读正文，主要要去读的就是前言和结果。
      对于不懂的图，这个结果如果不影响你对全文的理解可以先放着，最后再查资料，问师兄师姐。如果是关键图，那肯定是一些比较成熟的方法，上网查阅基本都可以找到相关解释，要学会自主学习，实在看不懂再去请教别人。
      再不济，可以在这边留言，或者发我邮件，咱们一起学习，我有很多也是别人问我，我再去查资料，这样学来的一些知识技巧

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  23. 你好！我是一名本科生，感谢博主的分享。祝您工作生活诸事顺利！

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  24. 师兄，你好。可以分享下Mac版的DNAMAN和Primer premier软件吗？

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  25. 青春总是美好的，但岁月静好后总会有人生的风风雨雨。希望永远看到这份活力！

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  26. 博主您好，我想请问一下miRNA数据库中您这边没有显示SEED区的序列，miRbase网站进不去，我还有什么别的办法可以知道我想查询的miRNA的seed区呢？

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    1. 同学你好 MiRBase里面没有提供seed sequence，如果您想查询seed序列，可以再靶基因预测工具获得seed区域。此外，种子区（seedregion）指的是miRNA上进化最为保守的片段，从第2个到第8个核苷酸，通常与mRNA 3’-UTR上的靶位点互补。

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  28. 你好进哥，我想请问一下如果进行PCR反应后要进行双酶切，那么设计突变引物的话，需不需要设计酶切位点呢

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    1. 不好意思，这两天比较忙没有及时看留言。我不太清楚你的突变PCR方法，如果需要定点突变，可以拿你构建好的野生型目的基因的重组质粒作为模板，设计突变引物，直接做PCR得到定点突变质粒，再涂板筛选。
      如果你就是在你扩增目的基因时候就在引物上引入突变位点，那你的酶切位点当然还是要加在两端。
      我不知道有没有理解错你的意思

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  29. 您好，想请问一个问题，慢病毒包装包装质粒是否可以通用？我们从别的组拿了两个慢病毒载体质粒，组内有别的慢病毒包装质粒，不知道是否可以通用？是否会受二代三代影响？

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    1. 你好，不同的质粒是可以通用的，只要保证你重新组合的慢病毒包装系统中含有必要的元件，可以参考这篇文章，在addgene网站查看各质粒信息慢病毒包装的简要操作说明。二三代从包装质粒结构上看，包装质粒应该是不可以通用，但是对于transfer质粒，二代包装系统可以兼容三代，反之不可以，具体可以查阅二者差异以及参考质粒图谱。

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  30. 师兄你好，我是西南大学动物学一名在读研二学生，前几个月找资料学习CRISPR的时候无意看到了你的网站，觉得师兄真的可棒，看到了你给每一个人的留言都认真回复。我今天晚上七点半要文献汇报，但是我现在PPT感觉还有好多问题，又看了一次师兄的网站，顿时觉得动力满满！！！加油加油！

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  31. 可新增一个点赞的功能，看完之后觉得想留下点什么，评论又不知道说什么，想点个赞再走，却发现无处可点。

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  33. 牛啊，我现在都是用印象笔记来记录试验生活之类的，偶然发现这个网站的，让人眼前一亮，非常不错，目前我是昆虫学在读博士，也算生物口了。这不错，希望保持下去，网站先收藏了，以后慢慢学习。点个赞~

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  34. 您好，看了您的网页让我眼前一亮，获益匪浅，感谢您的分享。另外想问一下，在image j中使用测量功能时，表格栏里有两项是BX，BY，请问是代表什么意思呢，默认的单位是像素吗，感谢！

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    1. 您好，不好意思 BX BY是在哪边 我没留意过，默认单位是pixel（像素），在Analyze–>set scale可以修改

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  35. 你好，我想问一下用Mfold预测的二级结构有结构1-5个结果图，该选用哪一个比较好呢？

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    1. 你好，这两天比较忙 没时间看回复
      看吉布斯自由能△G，越低应该越可靠吧 好像软件里就是按照吉布斯自由能排序的

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  36. 进哥您好：
    很感谢您分享了multimir的网页工具，但是出于学习的目的，我想在R上运行multimir，当我上传一个miRNAlist的时候，返回mmquery_bioc型的结果，想问下这个结果该怎么处理，谢谢！

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  37. 进哥您好：
    我想学习一下肺癌原位模型的制备方法，您网站里的视频打不开，能否分享一下操作视频呢？不胜感谢！

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  38. 王进哥哥，你好，你太厉害了，我是深大护理学在读的一名本科生，我想请教下如何创建自己的个人网站呢，我看了您给别人的回复，好像是用worldpress搭建的，请问有WP的安装教程分享吗？谢谢。

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    1. 同学你好
      这个比较简单，我是阿里云购买的服务器和域名，然后它上面可以迅速搭建环境，安装WP ，感兴趣加我微信聊，我的简历有手机号，微信同

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  39. 谢谢您的分享，收益颇多，请问DNAMAN 9在安装时需要User Name和Institution Name以及Serial No，但是安装包没有该如何解决？谢谢

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  40. 师兄您好，我是中科院在读博士生朱先玉，看到您网站上有很多动物模型的实验您是否有构建原位小鼠骨肉瘤（K7M2）模型的视频或者有北京的朋友在做原位种植骨肉瘤，我想学习一下，谢谢师兄。如果您北京有朋友可以帮忙教我的话后期论文发表的时候可以给帮忙构建的朋友论文挂第二作者，谢谢！

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  41. 也太棒啦 小哥哥有木有微博或者微信公众号呀 关注起来方便~

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  42. 您好！

    我安装了snapgene5.1.5，并且更改了语言，为什么还是不显示序列呢？

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    1. 好像5.1.5都有这样的问题 应该是防止盗版，5以上版本都不行。 建议用4.1.9 我一直用的这个版本

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    1. 你好
      链接：https://pan.baidu.com/s/1NV3-8EW7zkZs2ne7lMvVqg
      提取码：sxbn

      在这里面ref文件夹里面
      PS：这是genecode数据库里面的V22版本，目前已更新到V38（https://www.gencodegenes.org/human/）

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  44. 您好，我想问一下，软琼脂克隆形成率怎么计算，用啥软件呢

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  45. 你好，王进，我下载了你分享的snapgene,但是破解失败了，点击Patch And Register后，再点击yes，显示Patched but failed to activate.请问你知道是什么原因吗？如何解决呢？

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    1. 你好，你用的哪个版本？再试试其它版本（不建议中文汉化版），先使用5.1.5里面的清除工具确保完全清楚以往安装痕迹。我自己安装的是4.1.9版本，使用起来功能差不多 足够用

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  46. 你好，想请您一个问题啊。我们课题组最近正在建全身转移模型，请问左心室注射MDA-MB-231细胞到裸鼠，10万细胞/100Ul, 小鼠大量肠出血死亡，您是否有遇到过同样情况啊？有什么解决办法啊？为了防止细胞粘连，在细胞中加入了少量肝素。细胞量，是文献中已有报道的，是否需要再减量啊？

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    1. 您好，我们只用过尾静脉注射方式构建模型，左心室注射没有去尝试，最近如果有废鼠 我们也试试。咱们加个微信，方便讨论

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  47. 您好，我是一名肿瘤生物学硕士，看到您的站点使我眼前一亮，网页制作很精美，内容也很有学习价值。我看到站点底部附有wordpress的链接，您是用wordpress主题制作了本站点吗？还是您掌握了编程技术自己搭建的呢？我也在wordpress搭建了一个站点，但是远不及您的。

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  48. 您好，看到您的一篇文章写道DNA二级结构预测的网站MFold，请问这个网站现在还进得去吗？

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  49. 你好，之前有动物实验员上岗证考试的模拟考试系统是没有了吗，这系统做的很好，请问还会有吗，什么时候有

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